抑制miR-148a-3p通过恢复ATP6AP2介导的溶酶体酸化减轻PrPSc蓄积

《International Journal of Molecular Sciences》：Inhibition of miR-148a-3p Ameliorates Prion Accumulation by Restoring ATP6AP2-Mediated Lysosomal Acidification

　　

朊病毒病（PrDs）是以错误折叠朊病毒蛋白（PrP^Sc）蓄积及蛋白质量控制系统进行性损害为特征的致死性神经退行性疾病。溶酶体功能障碍和自噬流（autophagic flux）缺陷促进PrP^Sc蓄积，但其上游调控机制尚未完全阐明。研究人员在本研究中探讨了miR-148a-3p在朊病毒感染过程中的调控作用。研究人员发现，miR-148a-3p表达在ME7和139A感染小鼠脑组织及朊病毒感染SMB-S15细胞中显著升高。双荧光素酶报告实验证实，miR-148a-3p直接靶向PRNP 3′UTR，负向调控细胞型PrP（PrP^C）表达。在朊病毒感染细胞中，抑制miR-148a-3p可降低蛋白酶K（PK）抗性PrP（PrP^res），延迟实时震荡诱导转化（RT-QuIC）转换，并减少蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）扩增的PrP^res。通过生物信息学预测与实验验证，研究人员鉴定出ATP6AP2（ATPase H⁺ transporting accessory protein 2）——一种与液泡型H⁺-ATP酶（V-ATPase）相关的溶酶体酸化调控因子——为miR-148a-3p的高置信度靶点。ATP6AP2表达在散发性克雅氏病（sCJD）转录组数据、羊瘙痒病感染小鼠脑组织及朊病毒感染细胞中显著降低。重要的是，抑制miR-148a-3p恢复了ATP6AP2表达，改善溶酶体酸化并缓解受损自噬流。此外，ATP6AP2过表达直接降低SMB-S15细胞中PrP^Sc蓄积，并减弱RT-QuIC和PMCA实验中的朊病毒种子能力。这些发现表明，miR-148a-3p是朊病毒感染中ATP6AP2依赖性溶酶体功能障碍的上游调控因子。抑制miR-148a-3p可能恢复溶酶体清除能力并减少PrP^Sc蓄积，提示其可作为PrDs的潜在调控策略。

朊病毒病（prion diseases，PrDs）是以错误折叠朊病毒蛋白（PrP^Sc）蓄积和蛋白质量控制系统进行性受损为特征的致死性神经退行性疾病。溶酶体功能障碍及自噬流（autophagic flux）缺陷可促进PrP^Sc蓄积，但其上游调控机制仍未完全明确。该研究探讨了miR-148a-3p在朊病毒感染中的调控作用。研究人员发现，miR-148a-3p在ME7和139A感染小鼠脑组织及朊病毒感染SMB-S15细胞中显著升高；双荧光素酶报告实验证实miR-148a-3p直接靶向PRNP 3′UTR并负向调控细胞型朊病毒蛋白（PrP^C）表达。在朊病毒感染细胞中，抑制miR-148a-3p可降低蛋白酶K（PK）抗性PrP（PrP^res），延迟实时震荡诱导转化（RT-QuIC）转换，并减少蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）所扩增的PrP^res。通过生物信息学预测和实验验证，研究人员将ATP6AP2（ATPase H⁺ transporting accessory protein 2，一种V-ATPase相关溶酶体酸化调控因子）鉴定为miR-148a-3p的高置信度靶点；ATP6AP2在散发性克雅氏病（sCJD）转录组数据、羊瘙痒病感染小鼠脑组织及朊病毒感染细胞中显著降低。重要的是，抑制miR-148a-3p恢复了ATP6AP2表达，改善溶酶体酸化并缓解受损自噬流。此外，ATP6AP2过表达直接减少SMB-S15细胞中PrP^Sc蓄积，并降低RT-QuIC和PMCA实验中的朊病毒种子能力。上述发现表明，miR-148a-3p是朊病毒感染中ATP6AP2依赖性溶酶体功能障碍的上游调控因子；抑制miR-148a-3p可能恢复溶酶体清除能力并减少PrP^Sc蓄积，提示其作为PrDs潜在调控策略的价值。

研究背景方面，PrDs包括克雅氏病、羊瘙痒病、牛海绵状脑病和慢性消耗性疾病等，核心分子事件是内源性细胞型朊病毒蛋白（PrP^C）向感染性、易聚集的PrP^Sc构象转化，进而引起神经炎症、突触损伤和神经元损伤。神经元依赖自噬-溶酶体途径清除错误折叠蛋白，但PrDs进展中溶酶体功能和自噬流常受损，导致自噬泡堆积及PrP^Sc清除低效；其上游调控机制尚不清楚。ATP6AP2是V-ATPase功能所需辅助成分，参与溶酶体酸化、水解酶成熟及自噬体-溶酶体融合，但其在PrDs溶酶体功能障碍和致病性PrP蓄积中的作用尚未充分阐明。miR-148a-3p在神经退行和神经炎症中失调，但其在PrDs中的表达及是否调控PrP表达或溶酶体依赖性PrP^Sc清除未知。因此，该研究围绕miR-148a-3p在朊病毒感染中的表达、靶向关系及对溶酶体清除的影响展开。研究人员在感染小鼠脑和感染细胞中发现miR-148a-3p升高，证实其靶向PRNP 3′UTR并负调控PrP；抑制miR-148a-3p可部分减少PrP^res、延迟RT-QuIC转换并降低PMCA扩增；进一步鉴定ATP6AP2为高置信靶点，并证明抑制miR-148a-3p可恢复ATP6AP2、改善溶酶体酸化与自噬流；ATP6AP2过表达可减少PrP^Sc蓄积及种子活性。该研究的意义在于揭示miR-148a-3p/ATP6AP2轴作为朊病毒感染中溶酶体功能障碍的上游调控通路，并为增强PrP^Sc清除提供潜在调控策略。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用定量实时PCR（qRT-PCR）检测miRNA/mRNA，双荧光素酶报告验证直接靶向，Western blot与免疫荧光检测蛋白及PrP^Sc相关信号，PK消化评估PrP^res，RT-QuIC和PMCA评估种子/复制活性，LysoTracker Red、LysoSensor Yellow/Blue及mRFP-GFP-LC3评估溶酶体酸化和自噬流，并行生物信息学与GEO数据集分析。样本来源包括ME7/139A终末期感染小鼠脑、SMB-S15/SMB-PS/SMB-RES细胞、AD（APP/PS1）和PD（A53T）小鼠脑、HEK-293T、SH-SY5Y、SK-N-SH和N2a细胞，以及GEO GSE124571的sCJD转录组数据。

研究结果如下。2.1 朊病毒感染小鼠模型脑组织和感染细胞中miR-148a-3p显著升高：qRT-PCR显示ME7和139A感染小鼠终末期脑及SMB-S15细胞中miR-148a-3p显著升高，而miR-148b-3p和miR-152-3p变化有限；SMB-RES细胞中升高的miR-148a-3p明显回落，表达胞质型PrP的细胞及感染脑/细胞中前体miR-148a亦升高。2.2 miR-148a-3p直接靶向PRNP的3′UTR：三数据库预测获得270个共同候选靶基因并包含PRNP，双荧光素酶报告显示miR-148a-3p模拟物降低野生型PRNP 3′UTR报告活性，而种子区突变后该抑制消失。2.3 miR-148a-3p下调多种培养细胞中的PrP表达：在SH-SY5Y、SK-N-SH、N2a、SMB-PS等细胞中，模拟物一般降低PrP mRNA/蛋白，抑制剂增加PrP表达；SMB-S15细胞总PrP蛋白对miR-148a-3p调控反应较弱，但抑制剂使PrP免疫荧光信号增强。2.4 抑制miR-148a-3p部分减少朊病毒感染细胞中PrP^Sc蓄积及种子/复制活性：PK消化Western blot显示抑制剂组PrP^res略降，GdnSCN处理的PrP免疫荧光显示抑制剂组PrP阳性颗粒减少，RT-QuIC显示抑制剂组lag phase明显延迟，PMCA显示抑制剂组新生成PrP^res信号减弱。2.5 预测靶点ATP6AP2在朊病毒感染脑组织和细胞中降低：预测评分中ATP6AP2最高，sCJD转录组GSE124571中ATP6AP2显著下调，并与miR-148a-3p预测靶点交集富集于突触囊泡循环和溶酶体腔酸化；ME7/139A感染鼠脑及SMB-S15细胞中ATP6AP2蛋白/荧光信号降低，表达胞质型PrP的细胞中亦降低。2.6 抑制miR-148a-3p通过上调ATP6AP2恢复朊病毒感染细胞溶酶体酸化并缓解受损自噬流：qRT-PCR、Western blot和免疫荧光显示miR-148a-3p模拟物降低ATP6AP2、抑制剂升高ATP6AP2；双荧光素酶报告显示miR-148a-3p直接调控野生型ATP6AP2 3′UTR而非种子区突变报告；LysoTracker和LysoSensor Yellow/Blue显示抑制剂增强溶酶体酸化，mRFP-GFP-LC3显示抑制剂增加自噬溶酶体并减少自噬体堆积；自噬核心基因未预测到miR-148a-3p结合位点，p62/LC3-II变化轻微；ATP6AP2过表达降低p62并增强溶酶体酸化。2.7 ATP6AP2过表达减少朊病毒感染细胞中PrP^Sc蓄积和种子活性：PK消化Western blot显示ATP6AP2过表达显著降低PrP^res而总PrP无明显改变，GdnSCN-免疫荧光显示PrP阳性颗粒减少，RT-QuIC显示lag phase延迟、最大ThT荧光略降，PMCA显示新生成PrP^res明显减少。

讨论部分总结：该研究将miR-148a-3p识别为连接朊病毒相关蛋白蓄积与ATP6AP2依赖性溶酶体功能障碍的上游调控因子。miR-148a-3p在感染模型中选择性升高，SMB-RES清除朊病毒后回落，胞质型PrP表达亦诱导其升高，提示其与感染状态及异常PrP蓄积/错位相关；前体miR-148a升高提示转录或加工层面参与。miR-148家族共享种子序列，故不能完全排除miR-148b-3p对ATP6AP2的潜在贡献。非感染细胞中miR-148a-3p负调控PrP^C，而感染细胞中抑制ATP6AP2所致溶酶体清除受损占主导，可解释其对PrP^Sc蓄积的净促进作用。ATP6AP2为V-ATPase功能和溶酶体酸化所必需，生物信息学评分最高且双荧光素酶支持直接调控；其在sCJD数据、感染鼠脑、SMB-S15及胞质型PrP细胞中降低。抑制miR-148a-3p可恢复ATP6AP2并增强酸化，ATP6AP2过表达改善酸化并减少PrP^Sc蓄积/种子活性。自噬核心基因无预测结合位点，支持miR-148a-3p主要通过ATP6AP2依赖性溶酶体酸化影响自噬流，而非直接转录调控自噬组分。转化方面，sCJD转录组中ATP6AP2降低及ATP6AP2过表达减少PrP^Sc蓄积和种子活性提示该轴值得探索，但仍需体内验证。局限包括：主要基于两种羊瘙痒病小鼠终末期脑和细胞感染系统，其他毒株及不同疾病阶段是否保守未知；需纵向和细胞类型特异性分析；需体内功能缺失与挽救实验进一步确立因果；模拟物和抑制剂分别使用NC与NC-in可能带来基线差异；治疗有效性、安全性、特异性及递送未研究；miR-148a-3p抑制的脱靶效应不能排除，未来可借助转录组测序评估靶点特异性。

研究结论（原文结论翻译）：总之，该研究阐明了一条致病性调控轴：朊病毒相关miR-148a-3p上调抑制ATP6AP2，损害溶酶体酸化和自噬流，从而限制PrP^Sc清除。解除该抑制可恢复溶酶体稳态，并减少PrP^Sc蓄积及种子/复制活性。这些发现将miR-148a-3p/ATP6AP2轴确定为PrDs的潜在调控通路和治疗靶点。