DODAB疏水离子对自微乳化系统（SEDAB-SME）增强司美格鲁肽大鼠空肠吸收及急性血糖控制

《International Journal of Molecular Sciences》：A Hydrophobic Ion-Paired Self-Microemulsifying System Enhances Jejunal Absorption and Acute Glycemic Control of Semaglutide in Rats

　　

口服递送司美格鲁肽通过提高患者依从性，为2型糖尿病（T₂DM）提供有前景的策略。然而，其临床转化受限于低口服生物利用度，原因包括肽的亲水性、胃肠环境不稳定性及肠道通透性差。为应对这些挑战，研究人员将司美格鲁肽与阳离子脂质DODAB转化为疏水离子对（HIP）复合物（称为SEDAB），随后载入自微乳化给药系统（SMEDDS），得到SEDAB-SME。对两种阳离子两亲分子的比较筛选确定DODAB为所选反离子，其与司美格鲁肽形成稳定复合物。与DODAB离子配对显著增加司美格鲁肽的脂溶性，所得SEDAB-SME制剂增强其在模拟肠液中的稳定性，有效保护肽免受酶降解。体外，SEDAB-SME递送的FITC-司美格鲁肽显示明显高于天然FITC-司美格鲁肽的细胞关联，抑制剂研究提示涉及胆固醇敏感、脂筏相关内化途径。在SD大鼠空肠内（i.j.）区域肠道吸收研究中，与同i.j.途径给予的天然司美格鲁肽相比，SEDAB-SME使司美格鲁肽空肠吸收（F_rel = 0.12%）提高约28倍。在STZ诱导T₂DM大鼠的急性单剂量药效学研究中，口服SEDAB-SME肠溶胶囊显著降低血糖水平。这些结果表明HIP-SMEDDS策略显著增强区域空肠吸收，并在啮齿动物模型中产生急性降糖效应。该概念验证研究突出了一种有前景的方法，值得进一步验证直接口服药代动力学和长期安全性。

2型糖尿病（T₂DM）以胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能进行性下降为特征，是全球常见代谢性疾病。司美格鲁肽作为GLP-1（胰高血糖素样肽-1）类似物，可刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素、促进减重，并具有心血管和抗肥胖获益。注射剂有效，但口服可提高依从性；然而治疗性肽口服生物利用度极低，受酶降解、肠道通透性差和黏液屏障限制。商业口服片Rybelsus?采用渗透促进剂SNAC，但人生物利用度仍低（0.4–1%）、变异大，并有严格空腹、液体限制和胃肠道副作用。因此需要更高效稳健的口服递送策略。自微乳化给药系统（SMEDDS）遇水自发形成水包油微乳，可包载药物、屏蔽降解并增强黏膜穿透和跨膜转运；但司美格鲁肽亲水、在脂质辅料中溶解度差，限制载药。疏水离子对（HIP）通过肽与疏水反离子静电复合中和电荷、提高脂溶性，便于载入SMEDDS。既往HIP-SMEDDS已用于鲑鱼降钙素、艾塞那肽、胰岛素和奥曲肽等，司美格鲁肽也有体外及多库酯钠HIP-SMEDDS研究；但司美格鲁肽具有C18脂肪酸二酸链高度酰化、分子量约4.1 kDa、生理pH约7个净负电荷等特殊性，反离子选择影响复合物脂溶性、稳定性和SMEDDS相容性，最佳HIP伴侣、载入适用性、肠道吸收增强及体内血糖控制尚未系统评价。为此，研究人员筛选DODAB与TOAB，确定DODAB为最佳反离子，制备稳定复合物SEDAB并载入定制SMEDDS（SEDAB-SME），综合评估理化性质、细胞摄取与转运机制、药代动力学（PK）及T₂DM大鼠急性降糖疗效。该研究提供DODAB基HIP-SMEDDS从体外到体内的验证，整合机制、空肠吸收数据和急性药效学（PD）活性，具有重要意义。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用反离子筛选（DODAB与TOAB）制备司美格鲁肽HIP复合物，以沉淀效率、log p、FTIR、DSC和XRD表征；按辅料溶解度筛选并构建SEDAB-SME，测定粒径、PDI、zeta电位、体外释放及SIF蛋白酶稳定性；在Caco-2细胞中评价细胞摄取、Transwell跨膜转运及内吞/胞内运输抑制剂效应；在雄性SD大鼠中经空肠内（i.j.）给药进行PK研究；在STZ诱导T₂DM大鼠中经口服肠溶胶囊进行单剂量PD研究。Caco-2细胞购自Pricella；雄性SD大鼠及预建T₂DM模型大鼠购自Vital River，后者由供应商经4周高脂高糖饮食后单次腹腔注射STZ（35 mg/kg）诱导，空腹血糖>11.1 mmol/L确认。

研究结果：
2.1 司美格鲁肽–DODAB HIP复合物（SEDAB）的制备与表征：通过DODAB与TOAB在1:2至1:8摩尔比制备HIP复合物并以沉淀效率筛选，1:8时两者均达100%沉淀；通过log p测定，天然司美格鲁肽为?1.29±0.31，SE-DODAB为1.40±0.14，SE-TOAB为1.00±0.03；FTIR显示DODAB的N⁺-CH₃弯曲带强度降低，δ_sym由1398 cm^?1红移至1396 cm^?1；DSC中物理混合物保留DODAB约91.5 °C吸热事件，而SEDAB中消失；XRD中SEDAB的DODAB尖锐反射明显减弱或缺失，呈宽弥散；视觉和上清分析显示复合后浑浊沉淀，上清司美格鲁肽几乎检测不到。结论为成功形成SEDAB，DODAB因更高脂溶性被选。

2.2 SEDAB载入自微乳（SEDAB-SME）的制剂开发与表征：通过辅料溶解度筛选，SEDAB在Labrafac MC60中溶解度为6.46±1.87 mg/mL，选用Labrafac MC60、Peceol、Labrasol ALF、Kolliphor RH 40和丙二醇，按60:25:15（表面活性剂/助表面活性剂/油，w/w）制备；载药量为9.5±0.8 mg/mL，批间约8–10 mg/mL；稀释后自乳化，TEM显示球形纳米滴。体外释放中，有胆固醇酯酶时SEDAB-SME 6 h释放约60%，类似天然司美格鲁肽；无酯酶时仅约20%，天然有无酯酶均约60%。稀释1:20–1:200、pH 5.5–7.4下D_h约100–150 nm、低PDI、zeta电位?5至5 mV；2–8 °C储存7天后物理参数和自乳化能力相似，但药物含量降至82.1%（约18%损失，原因未确定）；SIF中SEDAB-SME保护司美格鲁肽，而天然司美格鲁肽快速降解。结论为物理特性、自乳化及酶保护获支持，但化学和药物含量稳定性未确立。

2.3 Caco-2细胞中SEDAB-SME增强细胞摄取和跨上皮转运：通过CCK-8确定10 μg/mL、5 h细胞毒性可忽略并用于后续实验；流式显示FITC-SEDAB-SME 4 h阳性细胞达43.53±3.02%，高于天然FITC-司美格鲁肽且随时间增加，CLSM见更强胞内荧光；但数据为总细胞相关荧光，不区分完整肽与标记降解产物。通过Caco-2单层Transwell，TEER未见破坏，P_app较天然司美格鲁肽高10.5倍，单层相关量更高。结论为整合SEDAB-SME增强跨上皮转运而不破坏单层完整性，但不能定量分离HIP复合物与辅料贡献。

2.4 Caco-2细胞中SEDAB-SME递送司美格鲁肽的摄取途径和胞内运输：通过内吞抑制剂MβCD、genistein、CPZ和amiloride，MβCD抑制细胞关联荧光62.4%，genistein无类似降低，CPZ和amiloride影响轻微，提示胆固醇敏感途径可能涉及非经典脂筏，但非定论；通过monensin、bafilomycin A1、brefeldin A和nocodazole，monensin使MFI增1.54倍，bafilomycin A1增1.76倍，brefeldin A和nocodazole无显著影响，提示可能高尔基转运和溶酶体分流；但FITC pH敏感及抑制剂脱靶使解释为指示性。结论为胆固醇敏感成分参与细胞关联，通路分配不能确定。

2.5 大鼠体内PK和PD：通过SD大鼠i.j.区域吸收PK，SEDAB-SME的F_rel = 0.12%，天然i.j.为0.004%，约提高28倍；天然i.j.的T_max中位0.167 h也早，且天然浓度多接近LLOQ，倍数仅为数量级估计。通过STZ-T₂DM大鼠口服肠溶胶囊单剂量2 mg/kg、6 h监测并于2 h恢复进食，SEDAB-SME在空腹期降低血糖并维持餐后控制，AUC_0–6h与皮下0.02 mg/kg无显著差异（p=0.9248），但皮下组个别时点数值更低；SEDAB-SME较T₂DM对照降低AUC_0–6h 29.7%，皮下司美格鲁肽降低35.1%但剂量低100倍。结论为增强空肠吸收并产生急性降糖，不能推断治疗等效。

讨论部分总结：反离子选择决定复合物脂溶性、稳定性和SMEDDS相容性；DODAB的双C18链较TOAB的C8链赋予更高log p；1:8为名义制备比例，并非确定化学计量。HIP提供载药所需脂溶性，SMEDDS提供自乳化、酶保护和递送功能，二者互补。pH 5.5–7.4窗口与HPMCP肠溶胶囊设计一致，避免胃液暴露；但7天药物含量损失约18%，不能作化学或长期稳定性声明。体外释放仅支持胆固醇酯酶促进释放，不证明体内完全解离或吸收分数。细胞转运增强主要符合跨细胞机制，表面活性剂浓度0.03%远低于打开紧密连接阈值；但无空白SME对照，不能排除Labrasol等辅料贡献；TEER不能排除短暂旁细胞，快速T_max可能含旁细胞/细胞旁成分。内吞和胞内运输证据为间接，MβCD最强而genistein无效可能符合非经典脂筏途径，但抑制剂脱靶和FITC pH敏感性限制解释；溶酶体分流是可靶向瓶颈。i.j. PK为区域吸收模型，手术残余影响不能排除；未测直接口服PK；PD两相模式与GLP-1受体激动剂临床药理一致，皮下组可能处于急性降糖反应平台，故相似血糖曲线不能解释为暴露等效或治疗等效。DODAB可能被胆汁盐促解离，阳离子脂质具膜破坏和黏液相互作用；既往高剂量 parenteral 毒性不能外推至本单次口服微乳，但重复给药口服毒性、黏膜相容性和长期安全性未建立，本研究仅CCK-8。局限性包括i.j.非口服PK、F_rel低0.12%且绝对口服生物利用度未测；稳定性仅7天冷藏且损失原因未明；单次急性剂量、安全性仅体外；机制间接、无表面淬灭/旁细胞标志/空白载体，Caco-2无黏液层；PK/PD路线剂量模型不同不能定量连接；n=5、STZ变异；无空白肠溶胶囊和SNAC阳性对照。

研究结论（翻译）：总之，尽管存在上述局限，本研究建立了一种具机制表征的HIP-SMEDDS策略，用于增强司美格鲁肽的肠道吸收。与DODAB疏水离子配对将亲水肽转化为适于高效脂质载药的亲脂复合物，SMEDDS载体在模拟肠液中提供酶保护。空肠内给予所选制剂使司美格鲁肽空肠吸收较天然肽提高约28倍（F_rel = 0.12%，相对于皮下注射），口服肠溶胶囊在STZ诱导T₂DM大鼠中实现急性降糖。然而，这些发现严格限于已证明的区域空肠吸收增强和急性PD反应；数据未确立口服生物利用度增强或治疗等效。应结合上述局限解释这些结果，包括采用空肠内而非口服PK评估、短期稳定性评价、急性单剂量设计以及缺乏DODAB长期口服安全性数据。除司美格鲁肽外，本研究提供初步证据表明该策略可能适用于其他亲水大分子治疗剂，但在实现其转化潜力前，仍需进一步验证口服PK、全面安全性评估及跨其他肽的通用性。