《International Journal of Molecular Sciences》：Towards Integrative and Multi-Scale Imaging with Recent Advances in Cryo-Electron Tomography
冷冻电子断层扫描（cryo-electron tomography, cryo-ET）能够在近天然状态下，对复杂生物环境中的分子架构进行三维可视化。近年来，样品制备、仪器设备、数据采集及计算处理方面的重大进展显著拓展了cryo-ET的应用范围。曾经通量低下且主要局限于少量薄样品和特定应用场景的工作流程，如今已可适用于多种不同样品，涵盖从分离的大分子组装体到细胞、类器官乃至组织等广泛对象。与此同时，（i）用于样品减薄的冷冻聚焦离子束（cryo-focused ion beam, cryo-FIB）铣削自动化流程及流线化倾斜系列采集方案的问世，（ii）高压冷冻样品（包括lift-out技术）改进方法的建立，以及（iii）日益整合的重建与处理管线的完善，均共同推动了该技术在通量、可重复性和可及性方面的提升。新兴的深度学习工具进一步促进了目标识别、带反馈回路的质量控制、断层图重建以及通过亚断层扫描平均（sub-tomogram averaging, STA）进行的下游分析。本文讨论了cryo-ET工作流程不同方面的最新进展，这些进展正逐步将分子尺度与细胞尺度相连接，并与多模态成像相结合。我们还强调了当前存在的局限性以及可能进一步拓展cryo-ET能力的新兴技术，特别是与互补方法相结合，朝着整合性结构细胞生物学方向发展的前景。
论文主体内容总结
- 1.
引言
电子显微镜（electron microscopy, EM）在生物学成像技术中具有最高的分辨能力。1986年，恩斯特·鲁斯卡因发展透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）获得诺贝尔物理学奖；2017年，雅克·迪博谢、约阿希姆·弗兰克和理查德·亨德森因发展冷冻电镜（cryo-EM）而获得诺贝尔化学奖。冷冻电镜领域从早期的“模糊球”时代取得突破，得益于像差校正电镜稳定性的提升、场发射电子枪质量的提高以及直接电子探测器（direct electron detectors）的出现，并结合能量过滤器以在低剂量成像条件下提高信噪比。如今，强大的软件实现持续支持现代显微镜上的高通量数据采集以及后续高效处理。
冷冻电镜依赖于玻璃化（vitrification）技术，可适用于广泛样品类型，样品经冷冻固定并形成玻璃态非结晶冰后处于冷冻水合状态。在无染色、化学固定或脱水的条件下，结构接近天然状态，密度直接反映蛋白质、脂质和核酸等生物内容物。传统上，该过程通过将悬浮于支持网格上的薄层生物分子浸入液氮温度冷却的液态乙烷或乙烷/丙烷混合物中进行 plunge-freezing 实现。“分辨率革命”之后，冷冻电镜的主要模式包括小晶体微电子衍射、分离大分子的单颗粒分析（single particle analysis, SPA）以及多形性或独特性物体的断层扫描。近期应用涵盖大型蛋白质复合物、柔性结构域和膜蛋白，用于研究构象异质性、组成状态及结构-功能关系。尽管样品制备仍然复杂且必须针对个案定制，最终目标是通过增加生物复杂性和完整性，弥合细胞生物学与分子生物学之间的分辨率差距，迈向整合性结构生物学。
- 2.
主体部分
2.1 冷冻电子断层扫描的样品制备方面
2.1.1 玻璃态切片或冷冻薄片上的细胞冷冻电子断层扫描
最初，电子断层扫描应用于化学固定、脱水和重金属染色后包埋于树脂中的超薄切片（通常低于100 nm厚度）。冷冻电子断层扫描的首次尝试是在细胞提取物或纯化细胞器、原核细胞、多形性病毒颗粒以及扁平或摊平的真核细胞（厚度小于1 μm）上进行的。cryo-ET主要应用于此类模型，特别是对于不适合SPA的稀有、多形性、异质性物体，但若单独使用则仅限于细胞外周区域。由于适合成像的样品尺寸受电子束平均自由程限制，研究者提出了在低温条件下使用超薄切片机进行切片的方法，即玻璃态切片冷冻电镜（cryo-electron microscopy of vitreous sections, CEMOVIS）。然而，CEMOVIS面临诸多技术挑战，如切片有效附着于网格以及压缩伪影等问题，限制了其广泛采用。
目前更常用的方法是使用聚焦离子束（focused ion beam, FIB）铣削制备冷冻薄片。低温FIB铣削可产生电子透明的横截面，即薄片（厚度通常为150至300 nm），利用FIB的特性避免了机械切片引入的机械应力。该技术最初为材料科学定制，后经改造应用于生物样品。一般而言，细胞在支持网格上沉积或直接生长，随后通过 plunge-freezing 玻璃化。薄片是样品经FIB铣削后依靠周围冷冻包埋生物材料悬挂于网格上的薄截面。早期工作流使用仅从样品顶部烧蚀材料的铣削模式产生“楔形薄片”，但由于难以实现TEM成像所需的均匀精确厚度以及去除网格底部冰污染等问题，目前倾向于从两侧铣削。该几何结构仍用于标准工作流，并配备气体注入系统（gas injection system, GIS）进行溅射涂层以保护样品免于过度铣削、减少curtaining效应并避免铣削或成像过程中的样品充电。溅射也作为最终步骤以提高薄片表面导电性，沉积的铂金属层足够薄而不影响后续cryo-ET数据采集。其他改进包括防止冰污染、自动化整个流程、多步铣削模式以及应力释放“微膨胀接头”以减少薄片上的机械张力。
除常用的镓离子源FIB外，近期发展了由氮、氙、氧或氩产生的等离子体耦合FIB。这些离子源提供更高的铣削速率，在某些情况下根据所用离子源特性减少铣削诱导损伤，并可能应用更低电压。目前多家制造商提供不同硬件和功能配置的商业系统。
2.1.2 类器官或组织标本的冷冻电子断层扫描工作流进展
除单层贴壁细胞系和小型细菌或酵母悬浮液（厚度小于10 μm）外，plunge-freezing不足以对厚度达约250 μm的样品进行充分玻璃化，此类样品需要高压冷冻（high-pressure freezing, HPF）。较厚样品如类器官、组织或植物，除非使用冷冻保护剂，否则玻璃化效果差，但冷冻保护剂可能引起伪影甚至渗透休克。对于非常大的标本，可在HPF前使用标准振动切片机进行切片。HPF传统上在小铝载体中进行，但此类装置与后续TEM中的cryo-ET数据采集不兼容，多年来已提出多种解决方案。
第一种方案依赖改良载体以使其兼容FIB铣削和后续cryo-ET成像。该方法因载体上铣削而提供高样品稳定性，理论上最小化转移过程中的直接接触。然而，当前设计需要使用专门设计的支架进行冷冻超薄切片，且需去除大量样品材料以获得可观察的薄片，严重限制了每个载体的通量。
第二种方案涉及将传统EM网格置于HPF载体内部，冷冻后可直接使用。该方法最初使用置于填充2-甲基戊烷的HPF载体中的EM网格上的秀丽隐杆线虫进行验证。由于2-甲基戊烷具有低升华温度（?160 °C），高于水的反玻璃化温度（?140 °C），网格上的样品可轻松从载体分离，便于直接进行表面cryo-FIB铣削。然而，2-甲基戊烷在冷冻前短暂孵育期间的潜在副作用尚不清楚，其在室温下的快速蒸发可能导致载体填充不完整，引起冷冻过程中的压力诱导伪影。此外，铣削过程中需去除大量冷冻包埋生物材料，限制了可制备的薄片数量。
另一种方案是“waffle方法”，基于将样品沉积在网格背面，夹在两个平载体之间进行HPF。该方法根据网格方孔的尺寸对样品体积施加限制。通过使用不同类型的网格，该方法可容纳细胞悬浮液、类器官和小型组织进行cryo-ET。然而，与传统网格上生长或沉积细胞的cryo-FIB铣削相比，仍有大量材料需去除，从而降低了薄片生产的通量并可能限制cryo-ET采集的倾斜范围。
最后，对体积较大的HPF后标本进行cryo-ET的另一种解决方案是“cryo-FIB-lift-out”方法，该方法使用微操纵器和夹持器将部分样品从载体转移到接收EM网格。该方法最初用于材料科学，后经改造用于室温树脂包埋生物样品，再用于低温条件。典型lift-out流程始于围绕感兴趣区域（region of interest, ROI）进行粗略铣削以形成块体（有时称为粗薄片），其表面通过FIB铣削过程中的材料再沉积附着，而使用GIS进行铂冷沉积是另一种选择。该连接可通过连接到微操纵器针尖的适配器或直接连接到针尖实现。附着完成后，使用FIB铣削将块体从样品其余部分分离，随后转移到接收网格。此外，可在所谓的“连续lift-out”或系列化工作流中通过FIB铣削从块体迭代制备约2–4 μm厚的切片，切片附着于接收网格的网格杆或网格孔上。附着到网格杆提供更高稳定性，特别是通过FIB铣削再沉积进行双位点附着时，但将块体和切片尺寸限制在网格尺寸和几何形状内。附着到网格孔则在样品尺寸和放置方面提供更多灵活性，但切片分离和附着依赖静电相互作用，有时不足导致切片丢失和产出低。尽管近期有所改进，cryo-FIB-lift-out方法仍具技术挑战性、通量低，且最关键的是大部分步骤缺乏自动化。
无论使用何种方法，组织上的cryo-ET面临若干挑战。一个困难是需去除大量材料以获得TEM成像透明的薄片，导致组织样品的薄片通量低于细胞，因为铣削时间长。低温等离子体FIB铣削的发展提供了缓解方案。使用氙离子束制备薄片可将时间减少至每站点约50分钟。此外，等离子体FIB系统似乎将铣削诱导损伤从镓离子的60 nm深度限制至氙的30 nm，影响两侧表面。此类损伤可通过低电压进一步最小化，如使用8 kV代替镓离子常用的30 kV。然而，低电压铣削导致探针尺寸增大，缓解相关curtaining副作用需要开发新铣削方案或针对生物应用定制仪器的实际改造。
cryo-ET中的另一个挑战是成像过程中ROI与样品其余部分缺乏区分，这在处理组织标本时被放大。这使得ROI靶向在cryo-FIB铣削期间不仅困难，而且在cryo-ET后数据集中其识别也不可靠，需要互补或正交方法进行验证和解释所观察到的表型。值得注意的是，由于cryo-FIB铣削，绝大部分样品体积被烧蚀而丢失。这些固有特征意味着薄片仅代表细胞拥挤且大得多的体积内发生的高度动态分子事件的微小快照。
2.2 协同更好：冷冻电子断层扫描与相关及整合框架
2.2.1 相关光镜和电镜（CLEM）
多年来，cryo-ET已与许多其他技术结合，如光学显微镜（light microscopy, LM），用于广泛使用的相关流程，可在室温或玻璃化后的低温条件下进行。cryo-ET和LM的优势和劣势使其真正互补。LM可用于缓解cryo-ET单独使用时的时间分辨率低和ROI识别困难的问题。LM可在cryo-ET工作流的不同阶段发挥作用：玻璃化前，室温LM允许对感兴趣事件或表型进行时间分析；玻璃化后，cryo-LM可帮助在FIB-SEM中于cryo-FIB铣削之前甚至之后定位ROI。
虽然ROI在xy平面上的靶向相对直接，但z维度上的相关性受该方向较低分辨率的影响。为缓解此问题，已描述多种在薄片铣削期间精确靶向ROI的用例。最直接的选择依赖于FIB-SEM腔室内的集成荧光显微镜（integrated fluorescence light microscope, iFLM）在薄片制备之前或期间监测荧光信号。尽管自动化能力正在实施中，由于大多数商用FIB-SEM中iFLM的物镜未定位于与电子束和离子束的重合点，不同成像模式之间的切换和配准主要手动完成。在具有此类特定硬件配置的显微镜中，近期发展已实现铣削过程中或薄片制备过程之间的实时荧光监测。然而，一个遗留问题是最终抛光步骤后，来自小颗粒的大部分荧光信号变得不可检测，在抛光前LM观察与后续cryo-ET分析的最终薄片之间产生间隙。
与此同时，在FIB-SEM中可通过iFLM、电子束或离子束轻松识别的荧光珠可用于相关目的。该方法理论上允许在自动化铣削前精确放置薄片。然而，铣削过程中因变形或漂移引起的网格和样品移动可导致错位和不准确的薄片靶向。此外，这要求荧光珠均匀分布且靠近ROI，与组织或类器官等大样品不兼容。
基于分子标签的目标识别方法持续发展，现已提供多种针对cryo-ET工作流定制的策略，包括金属纳米颗粒如金、金属螯合蛋白以及基于核酸或蛋白质组装的纳米结构。这些代表有前景的发展领域。
2.2.2 利用全细胞体积成像填补光镜与冷冻电子断层扫描之间的差距
虽然cryo-CLEM是靶向生物样品中ROI的最常用方法，但其受限于两种成像模式之间的分辨率差距。LM较低的分辨能力，加上样品内荧光信号定位的空间精度差，限制了铣削前或铣削期间的靶向。为克服此问题，已实施两种其他方法：用于体积成像的冷冻连续切片和冷冻软X射线断层扫描（cryo-SXT）。
冷冻连续切片或所谓slice and view是一种体积EM方法，在大空间背景下提供样品及其超微结构的各向同性三维表示。实践中，它使用FIB从样品表面烧蚀薄层材料，然后通过SEM以步进和重复方式成像。虽然此类体积EM方法已广泛用于室温化学固定和树脂包埋样品，其在冷冻样品上的应用仍较有限，原因包括充电效应、curtaining伪影等问题。GIS应用可减少表面形貌变化，但curtaining仍是大问题，主要由于冰污染、裂缝或细胞异质性导致的非均匀样品表面。光束诱导损伤、冰污染、显微镜不稳定性、长采集时间和低图像对比度进一步增加了低温体积EM的挑战。然而，冷冻slice and view FIB-SEM允许对ROI周围环境的部分进行背景化，并在应用于实际lift-out位点附近区域时协助目标定位。薄片制备也可通过SEM成像引导，逐步铣削顶面直至ROI可见，随后铣削底面以达到适合cryo-ET的厚度。
cryo-SXT基于低能X射线对冷冻水合样品成像，典型为完整哺乳动物细胞的三维纳米尺度成像，无需化学固定、染色或切片。这是通过在“水窗”能量范围内成像实现的，该能量范围内含氧和含碳结构以不同速率吸收入射光子，为生物样品产生天然固有对比度。在此能量范围内，软X射线可穿透达10 μm深度，允许对大多数细胞类型进行整体成像。虽然空间分辨率低于TEM（cryo-SXT约30 nm各向同性分辨率），该技术已成为以比LM更高的横向和轴向分辨率可视化三维细胞体积的强大工具，且辐射损伤影响小。因此，它也已与其他成像模式结合，包括cryo-CLXM和涉及cryo-EM/ET的多尺度实验。在cryo-CXEM背景下，cryo-SXT可与cryo-ET、cryo-FIB-SEM和cryo-lift-out等技术结合使用，通过多种成像技术之间的精确关联提供整体工作流。最近的整合工作流已在同一块样品上直接结合cryo-LM、cryo-SXT、cryo-FIB铣削和cryo-ET，为研究复杂样品和小标本（纳米颗粒）以及稀有细胞事件提供全面的多模态成像研究。虽然此前仅限于全球少数大型同步辐射设施，带等离子体源的“台式”紧凑型软X射线装置的发展很可能在未来几十年提高许多实验室的可及性。
2.2.3 面向原位结构生物学的整合方法
虽然CLEM、基于标签的方法和从cryo-ET数据直接推断等方法可实现细胞识别，但这些方法可能相当耗时和繁琐。此外，这些方法在系统全面地报告样品化学身份或分子异质性方面能力有限。新兴的结构和视觉蛋白质组学领域依赖于部分基于质谱（mass spectrometry, MS）的技术集合来表征细胞状态和组成。鉴于MS和cryo-EM/ET即使在并行进行时也提供高度互补的信息，结合它们对整合结构生物学的推进至关重要。许多MS技术现为无标记的，涵盖生物分子的代谢、结构和功能研究。蛋白质、脂质、核酸及其形成的生物分子组装体可在分离状态、整体或直接在生物系统中研究，也可在多种变性条件或天然MS下研究。MS技术与cryo-ET流程之间的良好相关性已在整合数据处理中得以体现，特别是应用于单一肺炎支原体以及更大的哺乳动物精子细胞时。
质谱成像（mass spectrometry imaging, MSI）代表另一种成熟方法，用于在低至中等分辨率下研究完整样品内生物分子的化学鉴定和定位，从而特别补充cryo-ET的结构成像。在MSI方法中，基质辅助激光解吸/电离（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）MSI是无偏的，可识别组织切片、单个细胞甚至亚细胞水平内大量小代谢物、脂质和蛋白质的空间分布。最近将cryo-ET和MALDI-MSI应用于同一标本，旨在TEM数据采集后直接在网格上评估细胞身份。该创新工作涵盖从细胞在EM支持网格上生长到cryo-ET数据采集和处理的完整流程，随后进行冷冻干燥、MSI采集和特定数据分析。尽管技术挑战大，这种组合方法可推断细胞间异质性、检测混合群体中的不同物种或多种细胞类型，甚至提供亚细胞组织的见解。另一项最新发表描述了使用cryo-FIB-SEM进行的二次离子质谱（secondary ion mass spectrometry, SIMS）化学成像，与cryo-LM兼容，并与细菌的cryo-EM分析以及真核细胞薄片的cryo-ET数据采集耦合。尽管有明确潜力，特别是避免基因修饰、外源探针或其他潜在显著细胞扰动的需要，这些方法目前仍相当小众且通量低，因为需要专门仪器。
对于连续研究，涵盖通过MS进行直接鉴定和样品表征的复杂流程输出令人瞩目。然而，MALDI-MSI在空间分辨率方面似乎相当有限（5 μm像素尺寸），而SIMS数据处于亚微米分辨率范围。但SIMS通常适用于小分子或无机分子，使脂质或蛋白质等生物分子无法被检测。因此，重大挑战仍然存在，正在进行的研究结果将有助于开发更用户友好和自动化的基于MS的方法，与cryo-ET标准工作流兼容，以分析原位多尺度动态生物系统的相互作用。
2.3 冷冻电子断层扫描的数据采集和处理
2.3.1 采集方案
实践中，cryo-ET将冷冻水合样品在TEM柱内物理倾斜，在每个预定义倾斜角下对给定ROI生成一系列二维投影图像。随后这些所谓倾斜系列被计算对齐为堆栈并在计算机中重建为断层图，以近天然状态表示样品体积的三维结构。根据载台几何形状，倾斜系列的单个图像通常从?60°至+60°的角度范围以2°或3°增量采集。载台力学限制倾斜限于±70°，且高倾斜时样品厚度增加，由于多次电子散射事件进一步限制信噪比。此类倾斜方案导致三维信息采样的非均匀性，称为傅里叶空间中的“缺失楔”（missing wedge），在实空间引起变形伪影。因此，断层图显示各向异性分辨率，物体在z维度伸长，垂直于倾斜轴的特征信息丢失。
此外，低温条件下观察的冷冻水合样品对电子束高度敏感，必须使用低剂量设置成像，每次采集都增加施加于样品的累积电子剂量。因此，系列后期采集的图像在累积光束诱导辐射损伤后获得，导致样品变形、弯曲或漂移，以及高分辨率信息减少、噪声和伪影增加。经典倾斜方案包括单向或双向数据采集，增量角范围变化。如今，常见cryo-ET实践更多依赖2010年代引入的剂量对称数据采集。在单向或连续倾斜方案中，采集从最高倾斜角之一开始并沿一个方向连续进行，特别适用于树脂包埋样品。在双向倾斜方案中，采集从0°开始，两个倾斜分支作为独立段顺序采集向正和负高角度。该方法特别适合自动化数据采集，但存在“跳跃启动”问题，因为累积辐射损伤在两个分支间分布不均。在剂量对称倾斜方案中，采集从0°开始并在正负分支中对称并行进行，在最低倾斜角保留高分辨率信息并逐渐累积电子剂量，便于处理堆栈对齐和亚断层扫描平均（sub-tomogram averaging, STA）。
相位板是置于TEM柱内物镜后焦平面的小型装置，用于电子调制和相移。它通过增加对比度来扩展cryo-EM和cryo-ET的能力，从而辅助下游数据处理。尽管实际限制阻碍了广泛应用，新设计和原型的改进正在不断报道。生物样品被视为弱相位物体，由轻元素组成，在TEM下产生很少固有对比度。Volta相位板的性能在多个用例中特别强大，包括cryo-ET研究。
最后，双轴倾斜方案近期受到关注，其中网格通过旋转支架经历90°载台倾斜。目标是在计算后获得给定ROI的额外数据，但在与单轴断层扫描相比的两个正交轴上采集，增加了三维信息采样量并最小化缺失楔效应。由于低温样品对辐射损伤高度敏感，有限的低剂量预算必须考虑并在同一位置收集的两个倾斜系列间相应分配，这对断层图重建和下游处理有影响。重要的是，与相位板诱导对比度增强相结合，双轴cryo-ET为埃博拉病毒的病毒颗粒结构及其与细胞骨架成分的相互作用提供了新见解。
2.3.2 自动、快速和可靠数据采集的软件实现
多种软件实现可用于TEM自动化数据采集，其中一些具有cryo-ET特定配置：EM-Tomo（TVIPS GmbH）、Leginon、SerialEM、TOM、Tomography（Thermo Fisher）和USCF Tomography。值得注意的是，SerialEM是主要的学术软件包之一，已被cryo-ET社区广泛使用。它作为开源免费分发，提供具有高度灵活性的多功能平台。用户对显微镜设置拥有完全控制以执行定制采集流程，但代价是学习曲线较陡。
与其他cryo-EM成像模式如SPA或微晶电子衍射相比，cryo-ET在通过STA实现高分辨率结构测定方面仍相对缓慢且具挑战性。一旦ROI被识别，传统倾斜系列采集协议要求一个靠近并沿倾斜轴定位的单独跟踪位置用于每个倾斜系列的采集。即使每个倾斜的跟踪和聚焦可在同一位置进行，适合cryo-ET的位点数量不仅受其在网格上随机分布的限制，还受高质量成像效率的限制。创新数据采集策略正朝着并行甚至连续方案发展以提高速度和产出。除用于预测校正建模的方法外，快速“连续”数据采集概念仍处于初期阶段。相反，基于光束图像位移（beam image shift, BIS）的多点断层扫描已被提出作为另一种高通量策略，涵盖BISECT和on-axis多点方案。最新的并行数据采集实现称为PACE-tomo和SPACE-tomo，作为SerialEM界面中的脚本已广泛应用于许多实验室和核心设施。其他近期工作开发了光束图像位移期间的连续记录（continuous recording during beam image shift, CR-BIS）以优化相机时间分配，从而加速cryo-ET和SPA的数据采集。
因此，更适合cryo-FIB铣削制备薄片的策略持续发展。这些薄片通常包含高价值的密集生物信息，但局限于有限区域。倾斜系列通常以足够间距采集目标以避免剂量积累和辐射损伤的累积效应。因此，相邻断层图常缺乏连续性，难以重建标本的整体架构或把握拥挤细胞内部的中尺度背景。当需要背景信息时，可采集中等放大倍数断层图以在几分钟内以极低剂量对整个薄片或大ROI成像。或者，montage断层扫描可用于收集多个重叠的高分辨率倾斜系列，最终覆盖大视野。然而，montage设置存在问题，标本需耐受与拼接相关的图像重叠所附加的电子剂量。此外，montage重建的瓦片拼接和倾斜系列混合仍具技术挑战性，尚未整合到最常用的处理工作流中。
中长期来看，建立类似SPA的多网格工作流已可实现。网格映射、ROI识别、倾斜系列采集目标选择、即时监测和多网格框架中远程报告的自动化将在多方面非常有益。首先，它将以可靠方式高效利用最先进的显微镜时间且用户输入最少。其次，它将确保具有相关表型、事件或特征的最高质量数据集。此外，cryo-ET与SPA采集策略如GisSPA的结合为原位高分辨率结构测定提供了有前景的方向。总体而言，这可简化数据采集参数以填充公共数据库，为更多令人兴奋的科学发现提供充足空间。
2.3.3 断层图重建和其他数据处理策略
cryo-ET中的数据处理是一个复杂且快速发展的领域，新方法和常为实验室特定的软件包以高速度引入，但缺乏跨平台整合。与SPA中CryoSPARC和RELION代表广泛采用、标准化且相对用户友好的工作流不同，cryo-ET仍缺乏普遍接受的处理流程和最佳实践指南。社区驱动的持续发展包括Warp与M以及RELION中的实现，还有新平台Relay。缺乏标准化和更流线化工作流仍然是新入门者的重大障碍，并限制了STA方法在原位大分子结构-功能分析中的更广泛采用。
断层图重建通常包括几个连续步骤：电影帧对齐、通过全局和局部精修的倾斜系列对齐、对比度传递函数（contrast transfer function, CTF）估计和校正、剂量加权以及通过反投影或其他迭代方法重建。最广泛使用的断层重建软件套件之一是IMOD包，涵盖montage对齐、断层扫描、CTF校正、滤波、可视化和分割等广泛应用。历史上，精确倾斜系列对齐依赖基准标记（fiducial markers），通常为玻璃化前添加到标本的金珠。在整个倾斜系列中跟踪这些基准并用于确定高质量断层图重建所需的对齐参数。虽然自动化批处理在一定程度上可行，但相对缓慢且常限于单个或类似数据集。
虽然基于基准的方法仍高度有效，但由于缺乏基准，它们通常不适用于薄片。在此类样品中，倾斜系列对齐改为依赖块跟踪（patch tracking），其中分布在视野中的图像区域或扇区包含的特征在倾斜之间被跟踪。由于块跟踪完全依赖标本的固有内容，其精度可能受限，特别是在低对比度或异质性情况下。投影匹配方法的引入，首先使用Protomo，后来使用AreTomo，显著改善了无标记对齐程序。这些方法迭代比较实验投影与中间重建体积的再投影，实现接近金基准获得质量的高度精确对齐。此外，AreTomo2引入了高效批处理能力，通过相对简单的命令行界面允许快速重建大数据集。最近，嵌入AreTomoLive中的AreTomo3通过整合额外预处理步骤扩展了此框架，包括运动校正、去噪、剂量加权和CTF校正，在统一重建工作流中实现。
近期发展探索了使用深度学习方法进行稳健、自动和无监督的断层图重建，如MissAlignment，它采用卷积神经网络基于“质量”分数优化断层子体积的对齐参数。该方法还评估含较少结构信息的区域是否可较少贡献于优化过程，从而降低异质性标本中伪影的风险。初步结果表明，使用这种新方法重建的断层图通过STA获得的结构可达到与终极基于参考的对齐方法相当的分辨率。然而，即使以子体积批次处理，计算成本仍然很高，根据计算基础设施，每个倾斜系列的总时间目前约为1小时。
断层图重建中日益增长的自动化使得以最少用户干预和即时方式处理大数据集成为可能。然而，实践中许多倾斜系列包含因污染、样品漂移、充电或视野中出现薄片边缘而产生的低质量图像。这些缺陷倾斜可显著降低最终重建质量。常见策略是排除低对比度倾斜，这通常足以去除受薄片边缘伪影影响的图像，但对其他图像退化来源效果较差。最近，已提出深度学习方法在重建前自动识别和排除劣质倾斜。此类方法可能有助于在cryo-ET处理流程中实现完全自动化的质量控制。
下游处理步骤包括对比度增强用于可视化、目标定位、样品背景表征以及最终定量分析。深度学习算法出现后恢复方法的可能性需在个案基础上谨慎考虑并采取适当控制措施。然而，这些方法有助于促进工作流其他方面并为许多现有工具的完全整合铺平道路。它们涵盖可视化辅助以及用于颗粒拾取、去噪和缺失楔补偿、图像分割和模式识别或大分子异质性表征的定量方法。与此同时，自动重建和即时反馈回路为使用cryo-ET的研究提供了全新途径。这些进一步代表了充分利用现有STA流程在生理相关背景下直接进行大分子高分辨率结构测定的先决条件。
- 3.
结论与展望
自发展以来，cryo-ET已被证明是在近天然状态和中等至高分辨率下可视化广泛生物样品分子环境的强大技术。过去十年见证了众多软件和硬件发展，使工作流日益自动化，并逐步将瓶颈从获得适合cryo-ET的样品转移到使用先进处理流程进行数据挖掘。关键进展包括cryo-FIB铣削自动化，实现从细胞高通量生产薄片且可重复性提高；使用深度学习辅助目标识别的薄片大面积自动采集；以及自动断层图重建。尽管有大幅改进，通过lift-out技术将cryo-ET应用于组织样品仍具挑战性、缓慢且通量相对较低。然而，用于更快铣削的等离子体FIB的发展，以及近期也可由深度学习辅助的自动化lift-out程序的进展，为更广泛可及性和扩大cryo-ET可能产出提供了有前景的前景。
基于人工智能（AI）的工具目前正在改变该领域的多个方面。首先，AI辅助特征识别正在促进样品制备的自动化。其次，它可通过自动化、快速和可靠的ROI靶向以及低信噪比图像的高效分析来加速和改进数据采集。最后，数据处理也在快速发展，为分割、颗粒拾取和原子模型构建开发了新方法。在后一领域，AlphaFold和相关结构预测方法通过促进cryo-EM密度图的解释和建模产生了特别深远的影响，并将在不久的将来继续对cryo-ET产生影响。
此外，若干硬件改进提供了令人兴奋的机会。首先，冷冻扫描透射电子显微镜（cryo-scanning transmission electron microscopy, cryo-STEM）可促进比常规cryo-ET薄片更厚标本的研究，包括超过500 nm厚度的样品。其次，将cryo-SXT与cryo-ET相结合的相关方法可提供基于cryo-FIB-SEM的破坏性体积EM slice-and-view方法的替代方案，同时在纳米尺度提供全细胞背景信息。最后，激光相位板的发展可显著改善低离焦值下的图像对比度，可能促进拥挤细胞内容物中生物结构的可视化和识别，同时保留高分辨率信息。
总体而言，本综述呈现的cryo-ET不同方面凸显了该领域有前景的未来。持续发展很可能使日益复杂和生理相关的标本研究成为可能，包括结合SPA和cryo-ET的组织和类器官。此外，新的用户友好和整合软件包正逐步缓解cryo-ET数据处理对新入门者和非专业人士的主要挑战之一。这些发展预计将扩大cryo-ET可访问的生物系统范围，同时增加可通过STA获得的动态大分子及其在细胞背景下近天然条件下相互作用的结构的数量和分辨率。
