《International Journal of Molecular Sciences》：High-Density Culture and Lipopolysaccharide Cooperatively Activate TAK1–MAPK Signaling to Promote Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp Stem Cells
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人牙髓干细胞（hDPSCs）因其多向分化潜能及易于从拔除牙中分离获取的特性，在再生医学领域具有广阔应用前景。研究人员前期报道高密度培养可增强其成骨潜能，但移植部位的炎症环境可能影响成骨分化。本研究探讨了脂多糖（LPS）对高密度培养条件下hDPSCs成骨分化的影
人牙髓干细胞（hDPSCs）因其多向分化潜能及易于从拔除牙中分离获取的特性，在再生医学领域具有广阔应用前景。研究人员前期报道高密度培养可增强其成骨潜能，但移植部位的炎症环境可能影响成骨分化。本研究探讨了脂多糖（LPS）对高密度培养条件下hDPSCs成骨分化的影响。hDPSCs分别以低密度或高密度接种，并给予LPS刺激。高密度培养可增加黏着斑激酶（FAK）磷酸化水平——这是整合素信号通路激活的公认标志物——并增强成骨分化能力。在高密度培养条件下，LPS进一步上调成骨标志物骨形态发生蛋白2（BMP2）和runt相关转录因子2（RUNX2）的表达，并促进矿化结节形成。此外，LPS刺激仅在低密度培养条件下诱导转化生长因子-β活化激酶1（TAK1）、p38和c-Jun N末端激酶（JNK）的磷酸化。TAK1抑制剂可抑制p38和JNK的磷酸化，并降低BMP2和RUNX2的表达。在高密度培养的LPS刺激hDPSCs中，FAK抑制剂可减弱TAK1磷酸化。上述发现表明，高密度培养相关的FAK信号通路可促进LPS诱导的TAK1–MAPK激活，从而增强hDPSCs中BMP2和RUNX2的表达及矿化结节形成。
一、研究背景与科学问题
人牙髓干细胞（hDPSCs）是来源于神经嵴衍生牙髓组织的间充质干细胞，具有广泛的多向分化潜能和强大的再生能力，在适当诱导条件下可分化为成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞和脂肪细胞等多种特化细胞类型。与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）相比，hDPSCs具有更高的增殖能力和更短的群体倍增时间，同时保持相当的成骨潜能，且可从包括第三磨牙在内的拔除牙中获取，为自体干细胞来源提供了微创途径，因此被认为是组织再生领域具有临床应用前景的BMMSCs替代方案。
在调控hDPSCs行为的诸多因素中，体外培养条件特别是细胞密度起决定性作用。高密度培养的hDPSCs成骨标志物表达和成骨分化能力显著增强，其机制涉及细胞间紧密接触的形成，进而激活整合素介导的信号通路，如黏着斑激酶（FAK）及其下游磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），促进碱性磷酸酶（ALPL）mRNA表达，从而推动成骨定向分化。体内实验亦证实高密度培养的hDPSCs具有更优的骨形成能力。
除物理培养条件外，炎症信号也能以情境依赖方式调控hDPSCs的行为和分化潜能。脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性菌外膜的主要成分，被广泛用于体外模拟炎症微环境。在hDPSCs中，LPS可激活Toll样受体4（TLR4）信号通路，诱导细胞因子产生并激活下游通路。然而，LPS对hDPSCs成骨/成牙本质分化的影响仍存在争议：部分研究报道LPS诱导的炎症损害分化潜能，另一些研究则显示通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路增强成牙本质分化。转化生长因子-β活化激酶1（TAK1）作为炎症与分化信号的中央介质，可被LPS等TLR配体激活并调控MAPK和核因子κB（NF-κB）通路，在间充质干细胞成骨分化中发挥关键调控作用，可能构成整合素介导的机械传导与TLR4介导的炎症信号之间的汇聚点，但两者间的相互作用尚不清楚。
二、研究内容与主要结论
本研究旨在探讨LPS刺激如何调控高密度培养条件下hDPSCs的成骨分化，并重点阐明TAK1依赖性信号的潜在机制。研究结果表明，高密度培养与LPS刺激协同作用可显著增强hDPSCs的成骨分化能力，其机制涉及FAK信号通路促进LPS诱导的TAK1–MAPK级联激活。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：从拔除的第三磨牙中分离hDPSCs并经流式细胞术鉴定细胞表面标志物（CD44、CD73、CD90、CD105、CD146阳性，CD31、CD34、CD45阴性）；RNA测序及生物信息学分析（主成分分析、差异表达分析、热图、基因本体论和KEGG富集分析）；逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证成骨标志基因表达；蛋白质印迹法检测信号通路蛋白磷酸化水平；茜素红S染色评估矿化结节形成；WST-8法检测细胞增殖；以及多种药理学抑制剂（NG25、HS-276、FAK inhibitor 14、IRAK4-IN-1、C25-140、BAY 11-7085）进行通路干预实验。
四、研究结果
2.1 LPS刺激改变高密度培养hDPSCs的转录组谱并增强成骨分化
RNA测序主成分分析显示三组间基因表达谱明显分离。高密度培养与LPS刺激的高密度培养组间鉴定出1270个上调和1153个下调基因。热图分析显示BMP2、RUNX1、RUNX2和BMP4等成骨相关基因表达从低密度至高密度再至LPS刺激高密度组逐步增加。RT-qPCR验证显示高密度培养显著上调BMP2、RUNX2、ALPL和BGLAP表达，LPS刺激仅在高密度条件下进一步增强BMP2和RUNX2 mRNA表达。茜素红S染色显示LPS处理组矿化结节形成显著增加。
2.2 高密度培养条件下FAK和ERK磷酸化增强
蛋白质印迹分析显示高密度培养显著增加FAK磷酸化，且不依赖LPS刺激。细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化在高密度条件下同样升高，LPS的额外效应甚微。
2.3 LPS诱导hDPSCs中TAK1和MAPK信号通路激活
高密度培养条件下TAK1、p38和JNK的磷酸化水平均升高，LPS刺激后三者磷酸化水平进一步增加，呈时间依赖性。
2.4 TAK1抑制剂对TAK1和MAPK信号组分磷酸化的影响
TAK1抑制剂NG25和HS-276均有效抑制LPS诱导的TAK1、p38和JNK磷酸化，而ERK磷酸化不受LPS或TAK1抑制的影响。
2.5 TAK1抑制剂对hDPSCs成骨分化的影响
NG25和HS-276均显著降低LPS刺激高密度培养hDPSCs中BMP2和RUNX2的表达，并减弱LPS增强的矿化结节形成，表明TAK1活性是LPS介导高密度培养hDPSCs成骨分化诱导所必需的。
2.6 上游通路抑制剂对TAK1磷酸化的影响
FAK抑制剂显著降低LPS刺激下升高的TAK1磷酸化。IRAK4抑制剂仅轻微降低TAK1磷酸化，TRAF6抑制剂则未抑制TAK1磷酸化。
2.7 NF-κB信号在LPS诱导hDPSCs成骨分化中的激活与作用
KEGG富集分析显示NF-κB信号通路显著富集，蛋白质印迹证实LPS在低密度和高密度培养条件下均增加p65磷酸化。然而NF-κB抑制剂BAY 11-7085不影响成骨标志物表达，表明NF-κB信号并非LPS诱导高密度培养hDPSCs成骨分化增强所必需。
2.8 LPS刺激对低密度和高密度培养hDPSCs增殖的影响
WST-8检测显示高密度培养显著降低细胞增殖，LPS刺激在低密度条件下显著抑制增殖，但在72小时时显著增加高密度培养细胞的增殖能力。
五、讨论与结论
本研究表明高密度培养条件通过激活FAK信号通路增强成骨相关基因表达，LPS刺激在高密度条件下进一步选择性上调BMP2和RUNX2表达及矿化结节形成，而非均匀增加所有成骨标志物。LPS诱导的TAK1磷酸化仅在高密度培养条件下可检测到，提示高密度培养和LPS刺激均为TAK1激活所必需。FAK抑制可减弱TAK1磷酸化，但高密度条件下升高的FAK磷酸化在无LPS时并未伴随TAK1磷酸化的相应增加，表明FAK信号可能为LPS诱导的TAK1激活提供许可性环境。TAK1通过下游JNK和p38而非ERK通路促进成骨分化。IRAK4和TRAF6抑制剂未能抑制TAK1磷酸化，提示可能存在TRAF6非依赖的TAK1激活机制，如TRIF/Pellino轴。NF-κB信号虽被LPS激活但并非成骨分化增强所必需。此外，LPS在72小时时恢复高密度培养抑制的细胞增殖，该效应可被TAK1抑制所减弱。
研究结论：高密度培养条件增加FAK磷酸化并增强hDPSCs成骨相关反应。LPS刺激在高密度条件下进一步增加BMP2和RUNX2 mRNA表达及矿化结节形成。机制上，LPS刺激诱导TAK1磷酸化及下游p38和JNK激活，TAK1抑制可减弱这些信号反应和成骨结局。FAK抑制可减弱LPS刺激高密度hDPSCs中TAK1的激活。这些发现表明高密度培养与LPS刺激联合观察到的增强成骨反应涉及FAK相关信号与TAK1–MAPK通路之间的相互作用，揭示了一个此前未被充分认识的整合素介导机械传导与炎症信号之间的关联，为炎症条件下牙科和骨组织工程策略的改进提供了重要见解。
