β-谷甾醇与柚皮素共载纳米植物体：包封特性、化合物特异性释放动力学、机器学习辅助释放预测及细胞依赖性抗癌活性

《International Journal of Molecular Sciences》：β-Sitosterol–Naringenin Co-Loaded Nanophytosomes: Encapsulation, Compound-Specific Release Kinetics, Machine Learning-Assisted Release Prediction, and Cell-Dependent Anticancer Activity

　　

β-谷甾醇（β-Sitosterol）和柚皮素（naringenin）具有抗癌潜力但生物药剂学性质较差，而它们在共包封时的行为仍缺乏明确界定。本研究考察了共载是否改变包封效率、化合物特异性释放行为、可预测性及细胞依赖性活性。研究人员对单载和共载纳米植物体进行了包封和释放表征。释放曲线经历了比较动力学建模、不确定性感知增强、早期至晚期岭回归预测、威布尔参数重建以及探索性重建重复留出评估。在A549（ATCC CCL-185）、HCT116（ATCC CCL-247）和HEK293（ATCC CRL-1573）细胞中评估了细胞毒性，并针对MEK1、COX-2和PI3Kα进行了分子对接。共载使β-谷甾醇的包封率从5.92%提升至66.61%，但将柚皮素的包封率从89.76%降低至40.40%（p = 0.02），共载制剂还表现出最小的囊泡尺寸（132.7 ± 3.2 nm）。在48小时，释放分别达到87.30%和73.24%；威布尔模型最佳描述了β-谷甾醇的释放，而Higuchi模型最佳描述了柚皮素的释放，揭示了异步释放和时间依赖性递送比率。在1200条增强曲线中，前4小时的测量值预测了6-48小时的释放，R2 = 0.976–0.996，而基于参数的曲线重建再现了化合物特异性轨迹。探索性重建重复留出评估产生了合并的R2值为0.938（平均绝对误差（MAE）= 3.32%；均方根误差（RMSE）= 4.78%）。共载制剂在A549细胞中显示出最强的相对活性，并且比游离组合更好地保持了HEK293细胞的活力，而游离组合在HCT116细胞中更具活性。柚皮素在所有靶点均产生对接结果（?7.58至?8.40 kcal/mol），而β-谷甾醇显示出较弱的结合且在COX-2未获得对接构象。共载与相反的包封趋势相关，由此产生的制剂表现出化合物特异性释放动力学和细胞依赖性响应，而非均匀增强的活性。整合理化表征、动力学区分、预测建模、对接和细胞测试，为双活性成分纳米植物体提供了一个多维度的研究框架。

一、研究背景与科学问题

β-谷甾醇（β-Sitosterol）是一种疏水性植物甾醇，柚皮素（naringenin）是柑橘来源的黄烷酮苷元，二者均具有抗增殖和促凋亡等抗癌潜力，但其水溶性差、生物药剂学性质不佳，限制了其制剂开发与体内递送。纳米载体给药系统为改善难溶性化合物的制剂特性和调控释放行为提供了机会。然而，当化学结构不同的两种化合物被共同包封于磷脂基纳米载体中时，化合物之间以及化合物与脂质之间的相互作用，加上分子结构和疏水性的差异，可能影响每种组分的保留和释放，导致非同步递送和随时间变化的释放比例。因此，单一化合物加载系统的行为无法直接预测多组分系统的表现，需要对共载系统的包封效率、释放动力学及其生物学效应进行系统性定量研究。此外，纳米制剂的生物学活性在不同细胞类型中可能存在差异，需在恶性与非恶性细胞模型中加以比较评估。

二、研究目的与意义

该研究旨在确定共载是否改变β-谷甾醇和柚皮素的包封效率、化合物特异性释放行为、释放的可预测性以及细胞依赖性抗癌活性。通过整合理化表征、动力学模型区分、机器学习预测、分子对接及多种细胞模型的活性评价，为双活性成分纳米植物体提供一个多维度的研究框架，揭示共载系统的复杂行为模式，并为后续优化设计提供依据。

三、关键技术方法概述

研究人员采用乙醇注入法制备了单载和共载的β-谷甾醇-柚皮素纳米植物体，配方中磷脂、胆固醇和聚乙二醇化磷脂的摩尔比为65:30:5。利用反相高效液相色谱法（HPLC）对两种化合物进行定量测定。通过动态光散射（DLS）表征粒径、多分散指数（PDI）和zeta电位，并使用扫描电子显微镜（SEM）观察冻干制剂的形态。采用透析袋扩散法进行体外释放实验。计算分析方面，基于实验数据的均值和标准差生成1200条增强释放曲线，应用零级、一级、Higuchi、Korsmeyer-Peppas和威布尔（Weibull）模型进行动力学拟合，并使用岭回归（ridge regression）模型进行早期至晚期释放预测和威布尔参数重建，同时进行了探索性的留一批次（leave-one-batch-out，LOBO）验证。采用MTT法在A549（人肺腺癌细胞）、HCT116（人结直肠癌细胞）和HEK293（人胚肾细胞）三种细胞系中评估细胞活力。分子对接研究则针对MEK1（PDB 3EQC）、COX-2（PDB 5KIR）和PI3Kα（PDB 4JPS）三个靶点，使用Schr?dinger平台的Glide标准精度（SP）模式进行。

四、研究结果

4.1 HPLC定量方法

建立了β-谷甾醇和柚皮素的HPLC校准曲线，分别在浓度范围内表现出优异的线性关系，回归方程分别为y = 2775.2x ? 11,179（R² = 0.9994）和y = 26,722x ? 180,299（R² = 0.9997）。

4.2 包封效率

共载对两种化合物的包封效率产生了相反的影响。与单载制剂相比，共载制剂中β-谷甾醇的包封率从5.92%显著增加至66.61%，而柚皮素的包封率从89.76%下降至40.40%。不同制剂间的总体差异具有统计学显著性（p = 0.02）。

4.3 理化与形态学表征

通过DLS测量发现，三种制剂的粒径存在显著差异（p < 0.001）。柚皮素单载纳米植物体粒径最大（473.8 nm），β-谷甾醇单载居中（199.6 nm），而共载制剂粒径最小（132.7 nm）。PDI方面，柚皮素单载制剂最低（0.235），显著低于β-谷甾醇单载（0.413）和共载制剂（0.450）。所有制剂均显示负的zeta电位，约?14至?17 mV，各组间无显著差异。SEM图像显示冻干的共载纳米植物体呈圆形的准球形囊泡结构，表面具有多孔纹理。

4.4 体外药物释放与计算分析

4.4.1 实验释放曲线

从共载制剂中，β-谷甾醇在30分钟时累积释放5.66%，48小时后增至87.30%；柚皮素在30分钟时释放23.80%，2小时为28.73%，48小时后缓慢增至73.24%，表明两种化合物具有不同的释放特征。

4.4.2 增强释放曲线的生成与评估

通过标准差（SD）知情采样和威布尔（Weibull）基础增强两种策略，共生成1200条增强释放曲线（每种化合物600条），这些曲线再现了实验释放的整体时间轨迹并传播了实验变异性。

4.4.3 威布尔（Weibull）动力学表征

β-谷甾醇的中位渐近累积释放量（Q_∞）为86.60%，尺度参数（α）为1.43小时，形状参数（β）为3.23，半释放时间（t₅₀）为1.18小时。柚皮素的中位Q_∞为70.58%，α为8.40小时，β为0.52，t₅₀为4.19小时。β-谷甾醇的β值大于1，表明释放曲线呈S形；柚皮素的β值小于1，表明初始快速释放后逐渐减缓。

4.4.4 释放动力学模型比较

对于β-谷甾醇，威布尔模型表现最佳，具有最低的校正赤池信息准则（AICc）值（32.48）、最高的赤池权重（0.753）、R²为0.966、RMSE为5.10%。对于柚皮素，Higuchi模型表现最佳，具有最低的AICc（26.38）、最高的赤池权重（0.841）、R²为0.959、RMSE为3.49%。

4.4.5 早期至晚期释放预测

利用前4小时的释放数据，岭回归模型对6、8、24和48小时的累积释放表现出高度预测一致性，R²范围在0.976至0.996之间，平均绝对误差（MAE）为1.00%-1.74%，均方根误差（RMSE）为1.17%-2.09%。

4.4.6 威布尔参数基础释放重建

岭回归模型预测威布尔参数Q_∞、α和β的MAE分别为0.910、0.353小时和0.431。由预测参数重建的释放曲线再现了化合物特异性的释放轨迹。

4.4.7 探索性重建重复留出评估

在留出一批次完整重建实验轨迹的LOBO分析中，模型在6、24和48小时的预测性能仍然较高，所有12个留出预测的合并性能为MAE = 3.32%，RMSE = 4.78%，R² = 0.938。该结果对β-谷甾醇0.5小时的不确定批次分配不敏感。

4.5 体外细胞活力评估

4.5.1 A549细胞

在A549细胞中，β-谷甾醇和柚皮素的纳米植物体制剂均比游离化合物更显著地降低细胞活力。共载纳米植物体在6-100 μg/mL浓度下比游离组合产生最大的活力降低。

4.5.2 HCT116细胞

在HCT116细胞中，β-谷甾醇纳米制剂优于游离化合物。但在100和200 μg/mL下，游离柚皮素比纳米制剂更有效。游离的β-谷甾醇和柚皮素组合在所有测试浓度下均比共载纳米植物体产生更低的细胞活力。

4.5.3 HEK293细胞

在HEK293细胞中，游离的β-谷甾醇和柚皮素组合在所有测试浓度下均比共载纳米植物体产生更低的细胞活力，表明共载制剂在该模型中更好地保护了正常细胞活力。

4.6 分子对接分析

柚皮素在PI3Kα、COX-2和MEK1三个靶点均获得了对接构象，Glide评分范围为?7.58至?8.40 kcal/mol，在COX-2处得分最优，达到参考配体罗非考昔（rofecoxib）得分的87%。β-谷甾醇在PI3Kα和MEK1得分较低（?5.45和?5.85 kcal/mol），且在COX-2未获得稳定对接构象。结合位点相互作用分析显示，柚皮素在PI3Kα与Val851和Asp933形成氢键，在COX-2与Ser530、Gln192、His90和Tyr355作用，在MEK1与ATP-γ-S、Ser212和Lys97接触。β-谷甾醇在PI3Kα与Asp933形成单个氢键，在MEK1与Arg234作用，但总体上不利接触数量较多。

五、讨论与结论总结

讨论部分要点： 共载对包封效率产生相反影响，表明该系统行为不同于单一制剂，但具体分子机制仍需光谱学等手段直接证实。共载导致粒径减小但分布并未收窄，说明平均粒径与分散性是描述制剂的不同属性。所有制剂的zeta电位无显著差异，表明静电排斥不足以解释胶体行为。释放动力学方面，共载产生非同步释放和随时间变化的递送比率，威布尔模型适合β-谷甾醇，Higuchi模型适合柚皮素。机器学习分析表明，在现有实验框架内，后期释放可从早期观测值进行预测，但需独立批次的前瞻性验证。生物学结果显示，制剂效应强烈依赖于细胞模型：在A549细胞中共载制剂效果最佳，而在HCT116细胞中游离组合更优，在HEK293细胞中共载制剂更好地保持了正常细胞活力。分子对接表明柚皮素与所选靶点的预测兼容性更一致，但对接分数和构象不能证明靶点参与或抑制。

研究结论翻译： 综上所述，该研究表明，共载β-谷甾醇和柚皮素会改变纳米植物体系统的多个相互关联的属性。该制剂表现出包封效率的相反变化、伴随更宽分散性的平均粒径减小、化合物特异性释放行为以及时间依赖性递送比率。动力学模型表征了这些独特的释放模式，而机器学习分析表明，在现有实验框架内，后期释放可从早期观测值进行估计。这些理化差异伴随着细胞依赖性生物学响应，而非活性的统一增强。共载制剂在A549细胞中显示出最有利的比较谱，而游离组合在HCT116细胞中仍更具活性。分子对接进一步确定了柚皮素是所选分子靶点中具有更一致预测相互作用的化合物，但这些计算结果不应被视为直接靶点参与的证据。