《International Journal of Molecular Sciences》：Unlocking the Power of Metaproteomics: A Novel Tool for Enhancing Shorebird Conservation and Blue-Economy Management
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宏蛋白质组学（metaproteomics，对环境或宿主相关样本中蛋白质进行大规模分析的方法）已成为表征微生物群落及其功能角色的变革性工具。与宏基因组学（metagenomics）或宏转录组学（metatranscriptomics）不同，宏蛋白质组学直接捕获
宏蛋白质组学（metaproteomics，对环境或宿主相关样本中蛋白质进行大规模分析的方法）已成为表征微生物群落及其功能角色的变革性工具。与宏基因组学（metagenomics）或宏转录组学（metatranscriptomics）不同，宏蛋白质组学直接捕获表型表达，将分子功能与生态和生理结果联系起来。除在人类微生物组和膳食研究中的既有应用外，宏蛋白质组学能够精确鉴定食物来源的蛋白质生物标志物，包括区分组织特异性来源。该分辨率水平无法通过基于DNA的方法获得。本研究首次应用宏蛋白质组学分析Cadiz Bay盐滩和盐沼中岸鸟的粪便，旨在以前所未有的分辨率确定其食性。基于直接观察或粪便检查的传统方法劳动强度大，并存在丢失关键食性信息的风险。相比之下，宏蛋白质组学提供快速、高分辨率的见解，为生态监测提供稳健替代方案。研究结果表明，该技术具有改变自然区域管理、优化鸟类保护策略并支持蓝色经济（blue economy）可持续发展的潜力。本研究强调宏蛋白质组学是一种创新、跨部门的方法，能够推进基础生态研究和实际保护成果。
研究背景与问题：海岸湿地是迁徙岸鸟的关键栖息地；食物可得性和质量影响栖息地利用、觅食策略和种群动态，自然潮间带和人为湿地（如沿海盐田）在高能量需求期是重要觅食地。传统食性研究依赖直接观察或粪便/食团中猎物残骸分析，耗时且有偏倚：小型猎物及缺乏硬质、抗消化结构的软体无脊椎动物常被低估，猎物差异消化可扭曲食性重建，传统方法可能不能完全捕获猎物多样性或尺寸谱。稳定同位素分析分类分辨率有限且通常需捕获个体；DNA宏条形码（DNA metabarcoding）提高分辨率但无法区分被食组织或提供猎物功能相关性直接信息，并受PCR扩增偏倚影响。宏蛋白质组学（metaproteomics，对环境或宿主相关样本中蛋白质进行大规模分析的方法）直接捕获表型表达，可鉴定食物来源蛋白生物标志物和组织特异性来源，且不依赖PCR。为此，研究人员首次将宏蛋白质组学用于Cadiz Bay盐滩和盐沼岸鸟粪便，以高分辨率确定食性，并评估其对自然区管理、鸟类保护策略和蓝色经济（blue economy）可持续发展的意义。研究显示，粪便宏蛋白质组谱以节肢动物和线虫蛋白为主，物种和季节间总体相似，但特定类群存在显著差异；该技术可检测传统形态学分析难以获得的分类信息，并可能减少处理时间和操作者依赖，但参考蛋白组数据库完整性和重复数仍限制分类分辨率与统计稳健性。
关键技术方法：样本来自Cadiz Bay盐滩和盐沼岸鸟，秋冬季和春季捕获；冬季用walk-in clap traps，繁殖期用funnel traps；收集新鲜粪便，4°C冷藏运输，?80°C保存。蛋白质提取后行小规模FASP（滤膜辅助样本制备）消化，C
18固相萃取，Vanquish Neo液相色谱与Orbitrap Exploris 240质谱联用，数据依赖采集（DDA，data-dependent acquisition）TOP15。自定义数据库两步缩减：Proteome Discoverer、Sequest和Percolator控制错误发现率（FDR，false discovery rate），保留至少两条肽段蛋白；Prophane分类注释，Python保留至少2/3重复，Krona可视化。统计用Shapiro–Wilk检验、Kruskal–Wallis检验、Dunn检验及Benjamini–Hochberg校正。
研究结果：
2.1. Custom Database Construction：研究人员分别构建无脊椎动物和岸鸟蛋白组数据库；岸鸟选用可获得近缘种，共81,995个蛋白用于过滤粪便中岸鸟蛋白，防止误判为无脊椎动物蛋白；无脊椎动物选择Spiralia、Cephalochordata、Tunicata和Ecdysozoa，经逐步缩减得Cephalochordata 2780、Ecdysozoa 79,092、Spiralia 11,758、Tunicata 417，共97,694个蛋白，用于高FDR下最终鉴定。结论是自定义数据库支持岸鸟粪便中无脊椎动物食性蛋白鉴定并降低岸鸟蛋白误判。
2.2. Protein and Taxon Profile of Shorebirds Feces：Proteome Discoverer高置信鉴定（至少两条肽段）得2037个蛋白、1120个clusters；仅1个禽源蛋白，2036个蛋白和1119个无脊椎动物蛋白组进入后续分析；Prophane纳入1968个有可定量丰度蛋白（1068个蛋白组），Python保留至少2/3重复后，各样本组最终蛋白数为552–826。结论是粪便蛋白谱以无脊椎动物来源为主，各岸鸟/季节组均获得可分析蛋白谱。
2.3. Taxonomic Analysis in Autumn/Winter Samples：秋冬样本鉴定约50个无脊椎动物目，各物种优势目相似：Rhabditida（线虫，9–16%）、Diptera（5–10%）、Lepidoptera（5–13%）、Hymenoptera（4–9%）、Coleoptera（5–9%）、Araneae（2–6%）、Decapoda（6–13%）、Hemiptera（3–6%）；Ixodida（2–4%）和Strongylida（2–3%）出现但非最丰；H. himantopus和T. totanus中Bivalvia达11%和14%，Ostreida达5%和11%，Mytilida达5%和<2%。结论是秋冬食性谱总体相似，但双壳类在H. himantopus和T. totanus更突出。
2.4. Taxonomic Analysis in Spring Samples：春季常见目为Rhabditida（9–13%）、Strongylida（2–6%）及8个节肢动物目：Diptera（8–11%）、Araneae（4–18%）、Decapoda（4–12%）、Lepidoptera（5–9%）、Hymenoptera（3–8%）、Coleoptera（6–7%）、Hemiptera（4–8%）、Sarcoptiformes（1–4%）。结论是春季谱与秋冬相似，仍以节肢动物和线虫为主，Araneae等比例有变化。
2.5. Sample Group Comparisons and Statistical Differences：Kruskal–Wallis检验和Dunn检验及Benjamini–Hochberg校正显示，Bivalvia尤其Ostreida在秋冬H. himantopus和T. totanus显著高于多数其他组，如C. alba（0.9%）、C. alpina（2%）低于H. himantopus（11%）和T. totanus（14%）；Ostreida在A. hypoleucos、C. alba、H. himantopus、T. totanus分别为0.2%、0.5%、5%、11%，且与春季多数组差异显著。Cestoda在C. alba较高（0.5–1%，春季最高1%），显著高于A. hypoleucos和H. himantopus，Cyclophyllidea贡献主要差异。Architaenioglossa多数秋冬样本（0.09–0.2%）高于春季（0.007–0.04%），例外为A. hypoleucos秋冬0.06%和春季C. alba 2%；S. albifrons春季最低0.007%，Charadrius spp.由秋冬0.2%降至春季0.04%。Branchiopoda在S. albifrons达5%，高于其他组0.3–2%，校正后与H. himantopus秋冬、T. totanus秋冬、C. alba春季、R. avosetta春季仍显著。Arachnida秋冬8–12%低于春季10–29%，C. alba和R. avosetta分别达24%和29%，未校正提示差异但校正后不显著；C. alba中Arachnida差异主要与Sarcoptiformes和Trombidiformes有关。结论是特定类群存在物种/季节差异，双壳类、绦虫、腹足类、鳃足类和蛛形纲呈现不同模式。
2.6. Representation of Invertebrate Taxa in the Metaproteomic Analysis：研究人员比较Cadiz Bay记录的无脊椎动物类群与UniProt参考数据库最接近代表，涉及19目10纲42个条目；多数有分类相关代表，部分如chironomids、Ixodes spp.、Formicidae、Ephemeroptera、Enochrus spp.、Hydrophilidae、Berosus spp.、Amphipoda有近缘代表，Artemia spp.和Hydrobia spp.较远；11个条目缺乏明确代表或存在歧义，如Trichoptera最接近Lepidoptera、Plecoptera最接近Orthoptera，因此蛋白匹配不应视为明确种级鉴定。本研究还检测到传统方法记录的类群及额外arachnid目、copepods、Hemiptera、Hymenoptera、Ephemeroptera；Nematoda为最丰富无脊椎动物相关蛋白之一。结论是宏蛋白质组学可补充传统调查，但分类分辨率受参考数据库完整性限制。
讨论总结：总体宏蛋白质组谱在物种和季节间 broadly similar，节肢动物和线虫蛋白最丰富，提示不同岸鸟可能利用相似营养资源，至少分析期如此；Diptera和Coleoptera等主要节肢动物目此前已被描述为Cadiz Bay越冬岸鸟食性重要类群。Pérez Hurtado et al.未报道的Hymenoptera、Araneae、Decapoda和Hemiptera，在Sanchez et. al.对Odiel河口盐沼T. totanus食团/粪便研究中检测到，且Hymenoptera在冬季与Diptera相关、Decapoda冬季出现率增加，与本研究一致；但仅部分类群校正后显著。Bivalvia尤其Ostreida在H. himantopus和T. totanus秋冬较高，可能与形态特征、觅食策略和微生境选择有关；T. totanus（Scolopacidae）和H. himantopus（Recurvirostrinae）可能更适合利用沙泥底埋藏/半埋藏双壳类，与喙长、形状、触觉敏感性及探测埋藏猎物能力有关；T. totanus食性研究显示双壳类常见，软体动物秋季更重要，且两种鸟双壳类摄入高于Charadrius spp.；但这些发现不应解释为直接食性偏好证据，因为未独立评估猎物可得性和栖息地利用。Architaenioglossa秋冬较高与Odiel盐沼T. totanus冬季摄食更多腹足类一致。Branchiopoda在S. albifrons春季较高，大型鳃足类常与临时湿地、盐沼、咸水或超盐水相关，是S. albifrons觅食栖息地；局部无脊椎动物调查记录其存在，可能解释该模式。Arachnida春季较高但校正后不显著；Cadiz或Andalusia盐滩缺乏特定季节丰度研究，西班牙东部和地中海岛屿报道Araneae群落春季增加，提示季节变化可能贡献，但该解释为探索性。Cestoda在C. alba尤其春季较高，需谨慎，可能反映寄生虫感染而非直接猎物消费；Belizean海岸Charadriiformes研究在Calidris fuscicollis等相关种检出多种cestode。与传统Cadiz Bay粪便/食团和直接观察研究比较，昆虫（Diptera、Coleoptera）、甲壳类（Amphipoda、Decapoda、Ostracoda、Isopoda、Branchiopoda）、软体动物（Gastropoda、Bivalvia）和环节动物（Polychaeta）检测一致；宏蛋白质组学还检测到arachnids尤其Ixodida，其他arachnid目Mesostigmata、Araneae、Sarcoptiformes、Scorpiones、Trombidiformes；Araneae最丰富，Trombidiformes包括适应盐沼栖息地物种，尤其高地或植被区；还鉴定copepods（Hexanauplia）和昆虫Hemiptera、Hymenoptera、Ephemeroptera，也是Cadiz盐滩典型无脊椎动物。Nematoda蛋白在粪便中检测是 noteworthy，传统调查未记录；有证据显示Cadiz Bay盐沼和盐滩存在线虫，潮间带动物和区域工作在湾内及邻近海岸沙丘沉积物检测到线虫，盐沼大型动物综述表明环节动物和线虫是底栖群落优势组分；西班牙其他地区研究在T. totanus食团/粪便中鉴定线虫。尽管线虫和绦虫蛋白可能与寄生虫相关而非直接消费，未检测线虫也可能由传统食性分析限制解释：小型软体生物几乎完全消化而未被发现；仅粪便分析可导致错误结论，因为只有蠕虫留下痕迹，研究者可能从粪便分析推断所有观察都发现蠕虫，而实际上有些部分其实是蛤蜊虹吸管；这些限制也可解释多毛类相比先前研究相关性较低，该组可能被高估；仅粪便分析不是推断鸟类食性选择的最佳方法。因此本初步研究强调宏蛋白质组学识别与传统方法一致食性模式的潜力，同时检测传统分析可能忽略的分类群；尤其可帮助解决基于粪便或食团的食性分析限制，特别是差异消化和小型软体生物代表性不足；与DNA方法互补，避免PCR偏倚，提供分类信息及蛋白功能特征和组织来源见解；稳定同位素反映同化资源但需组织采样且分类分辨率有限；宏蛋白质组学避免组织提取，相对侵入性较低，具有生态和保护研究潜力；但依赖蛋白参考数据库完整性和分类覆盖，可能影响某些生物检测和分类分辨率。
研究结论翻译：对Cadiz Bay盐沼和盐滩岸鸟粪便的宏蛋白质组分析揭示多样分类谱，以节肢动物相关蛋白为主，物种和采样季节间模式 broadly similar；但校正多重比较后特定分类群存在显著差异，包括秋冬H. himantopus和T. totanus中Bivalvia尤其Ostreida蛋白相对丰度较高，以及Branchiopoda和Architaenioglossa差异。这些发现与传统食性研究一致，支持宏蛋白质组学作为传统食性分析替代方法的潜力；此外，该方法允许在相似营养谱中检测分类群特异性差异。除生态学发现外，宏蛋白质组学提供传统粪便残骸形态学检查难以获得的分类信息；尤其检测到广泛无脊椎动物类群蛋白，包括可能留下很少可识别残骸的生物，提供比仅基于粪便分析的食性研究更详细的粪便组成表征；鉴定与潜在寄生虫如cestodes和nematodes相关蛋白强调区分食性组分与粪便样本中其他生物来源的重要性。因此，宏蛋白质组学是传统形态学食性分析的有前景替代方法，可减少处理时间和依赖操作者视觉鉴定；然而，进一步改进参考蛋白组数据库和足够组间重复对于增强分类分辨率和统计稳健性至关重要，最终促进传统方法替代。
