NAMPT–MMP-9轴与囊性纤维化慢性炎症相关：循环eNAMPT、MMP-9及ETI治疗后的变化

《International Journal of Molecular Sciences》：The NAMPT–MMP-9 Axis Contributes to Chronic Inflammation in Cystic Fibrosis

　　

慢性炎症是囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）肺损伤的主要驱动因素，但维持这种自我强化炎症状态的分子机制仍不完全明确。烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）是NAD生物合成的限速酶，也可在细胞外（extracellular NAMPT, eNAMPT）作为促炎介质发挥作用。本研究探讨了CF中NAMPT与基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）之间的关系。与non-CF对照相比，CF患者（people with CF, pwCF）的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）显示细胞内NAMPT和MMP-9表达升高，并伴有AKT和ERK1/2磷酸化增强。pwCF循环eNAMPT水平升高，并与MMP-9水平呈正相关。尽管基线eNAMPT水平与FEV₁% predicted无显著关联，但在一个小型纵向队列中，eNAMPT在一年elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor（ETI）治疗后下降，而七名具有配对测量的患者中有六名FEV₁% predicted升高。体外，重组NAMPT增加健康供者PBMCs中MMP-9表达及酶活性。FK866药物处理降低内源性eNAMPT释放并减弱NAMPT诱导的MMP-9产生。机制上，eNAMPT触发快速AKT激活，随后出现持续ERK1/2磷酸化。MEK/ERK通路的药物抑制减弱NAMPT诱导的MMP-9活性，支持ERK1/2信号对NAMPT介导MMP-9激活的功能性贡献。综上，这些发现鉴定了一个与CF炎症信号相关的功能性NAMPT–MMP-9轴。尚需进一步研究以确定其对肺部炎症的贡献，并在更大患者队列中确定循环eNAMPT的临床意义。

囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）是由囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR）基因突变引起的常染色体隐性多系统疾病，慢性气道感染和进行性呼吸功能不全是其核心表现。慢性、异常的炎症反应是CF疾病进展和相关并发症的重要驱动因素，但其涉及分子与细胞机制仍未充分阐明。CFTR调节剂尤其elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor（ETI）可改善多数CF患者（people with CF, pwCF）的肺功能和生活质量，并报道具有抗炎作用，但部分患者因突变类型无法产生CFTR蛋白或对现有分子治疗应答不足，仍存在持续炎症，因此需要进一步识别维持炎症的分子通路。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）参与细胞外基质降解、免疫调节和中性粒细胞炎症放大，在pwCF的痰、支气管肺泡灌洗液和血浆中升高，并与FEV₁等肺功能参数呈负相关；有效CF治疗可下调血浆MMP-9。烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase, NAMPT）是NAD生物合成的限速酶，也是损伤相关分子蛋白，可释放至细胞外形成细胞外NAMPT（extracellular NAMPT, eNAMPT），通过结合细胞膜受体发挥促炎介质作用。既往研究提示CF支气管上皮及LPS激活的CF中性粒细胞中NAMPT表达上调，但NAMPT与MMP-9在CF中的功能关系尚未被研究。因此，研究人员旨在探讨NAMPT/eNAMPT与MMP-9在pwCF炎症放大中的相互作用及其信号通路。研究人员比较了pwCF与non-CF受试者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）和血浆中的NAMPT、MMP-9及AKT/ERK1/2磷酸化，分析了循环eNAMPT与MMP-9的相关性及ETI治疗后的变化，并在健康供者PBMCs中采用重组NAMPT、FK866和U0126进行体外机制验证。研究得出，pwCF的PBMCs中NAMPT和MMP-9升高并伴AKT、ERK1/2磷酸化增强，循环eNAMPT升高且与MMP-9正相关，ETI治疗后eNAMPT下降；重组NAMPT可增加PBMCs中MMP-9表达和活性，FK866及MEK/ERK抑制可减弱该反应，支持存在与CF炎症信号相关的功能性NAMPT–MMP-9轴。其意义在于为CF慢性炎症的分子机制提供线索，并提示循环eNAMPT可能作为炎症相关标志物及该轴作为干预方向的潜力，但原文强调尚需疾病相关模型和更大纵向队列验证。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究纳入pwCF与年龄可比non-CF对照的血浆和PBMCs，健康供者血浆来自Alessandria医院当地血库（AOU-AL），研究经Genoa的G. Gaslini Children’s Hospital伦理委员会批准（方案号A-CF2014 460REG2014）；ETI纵向队列8例，其中7例有eNAMPT与FEV₁% predicted配对测量。关键技术包括PBMC分离与血浆采集、ELISA检测eNAMPT、Western blot检测MMP-9/NAMPT及磷酸化AKT和ERK1/2、明胶酶谱检测MMP-9酶活性、重组人NAMPT刺激、FK866（NAMPT抑制剂）和U0126（MEK/ERK通路抑制剂）处理，以及差异比较和相关分析。

研究结果：
2.1. MMP-9、NAMPT及促炎信号在pwCF中持续高于non-CF正常受试者
研究人员通过Western blot比较同一队列pwCF与non-CF受试者PBMCs，发现pwCF的PBMCs中MMP-9和NAMPT胞内蛋白水平显著升高，同时磷酸化ERK1/2与磷酸化AKT水平显著升高；表明这些蛋白及促炎信号通路在pwCF的PBMCs中持续激活。
2.2. 循环eNAMPT水平在pwCF中升高并与MMP-9相关
通过ELISA和Western blot分析血浆样本，研究发现pwCF血浆eNAMPT水平较年龄可比non-CF对照显著升高，约增加11.2倍，MMP-9蛋白水平亦显著升高；pwCF循环eNAMPT与MMP-9水平呈正相关（Spearman’s r=0.55）。在ETI治疗一年后的纵向队列中，8例患者eNAMPT显著下降；基线eNAMPT与FEV₁% predicted无显著相关；7例配对患者中6例eNAMPT下降而FEV₁% predicted升高，但二者变化无显著相关。原文指出现有数据未建立循环eNAMPT与肺功能的直接关系。
2.3. eNAMPT增加MMP-9表达和活性，NAMPT抑制可降低
研究人员将健康供者PBMCs与递增浓度重组人NAMPT共培养24 h，通过Western blot和明胶酶谱发现rNAMPT显著增加培养上清中MMP-9蛋白水平和酶活性。FK866在rNAMPT存在时降低MMP-9活性，并显著降低条件培养基中内源性eNAMPT水平；在无外源rNAMPT时FK866对基础MMP-9活性呈下降趋势但未达统计学显著。低浓度FK866处理24 h不影响PBMC活力。原文指出实验尚不能区分FK866对细胞内NAMPT抑制与对细胞外NAMPT信号的影响。
2.4. 重组NAMPT激活AKT和ERK1/2信号，ERK1/2抑制减弱MMP-9活性
研究人员用rNAMPT刺激健康供者PBMCs，通过Western blot发现2 h后AKT和ERK1/2磷酸化显著升高；AKT磷酸化随时间下降，而ERK1/2磷酸化持续至24 h。使用MEK/ERK通路抑制剂U0126后，ERK1/2磷酸化降低，rNAMPT诱导的MMP-9活性减弱，支持MEK/ERK信号对NAMPT诱导MMP-9活性的功能性贡献；AKT是否也功能性参与MMP-9诱导尚待确定。

讨论部分总结：讨论指出，慢性非消退炎症仍是CF肺损伤和进行性肺功能下降的主要决定因素，即使在高有效CFTR调节剂时代亦然；持续性中性粒细胞炎症和过度蛋白酶活性是CF肺病标志，但维持机制未完全明确。该研究识别eNAMPT与MMP-9之间的功能关系，可能参与pwCF系统性炎症激活。CF虽主要累及气道上皮，但免疫失调也涉及循环白细胞，pwCF的PBMCs具有炎症表型并激活MAPK和PI3K依赖信号；本研究将NAMPT纳入该表型，且与既往CF支气管上皮NAMPT表达增加的转录组分析一致，提示NAMPT失调可能涉及肺和外周 compartment。研究主要发现重组NAMPT促进PBMCs中MMP-9表达和酶活性；MMP-9是CF肺病理的已知介质，参与细胞外基质降解和气道重塑，循环eNAMPT与MMP-9正相关及rNAMPT体外效应提示eNAMPT可能参与MMP-9调控，但临床相关性为关联性，不能建立患者中的直接因果关系。机制上，rNAMPT引起较短暂AKT反应和持续ERK1/2磷酸化，U0126减弱NAMPT诱导MMP-9活性，支持ERK1/2通路贡献，但不排除其他通路。FK866降低NAMPT诱导MMP-9活性并呈降低基础MMP-9活性趋势，还降低条件培养基内源性eNAMPT而不影响总蛋白，提示胞内NAMPT活性可能影响eNAMPT释放；但当前实验不能区分胞内NAMPT抑制与FK866对胞外NAMPT信号的影响，eNAMPT分泌机制仍需澄清。ETI治疗一年后循环eNAMPT下降，与CFTR调节剂减轻系统及气道炎症及既往循环MMP-9下降一致；但基线eNAMPT与FEV₁% predicted无显著关联，小纵向子集中eNAMPT下降而FEV₁% predicted升高的变化亦无显著相关，需更大纵向队列确定临床意义和生物标志物价值。讨论还提及感染相关上皮损伤和重塑背景中MMP-9可能是连接炎症激活与细胞外基质重塑的合理介质，但相关研究为不同实验系统，未确立NAMPT在这些过程中的作用，且本研究未直接评估气道上皮反应、细胞外基质降解或肺组织重塑。局限包括ETI纵向分析患者数少、机制实验主要在健康供者PBMCs中进行、循环eNAMPT和MMP-9细胞来源未确定、受体及分子机制未完全阐明；需疾病相关模型和呼吸道样本进一步明确该轴对CF相关肺部炎症的贡献。

研究结论部分翻译：综上，该研究鉴定了囊性纤维化（CF）背景下NAMPT/eNAMPT与MMP-9之间的功能关系。研究人员发现CF患者（pwCF）外周血单核细胞（PBMCs）中胞内NAMPT和MMP-9水平升高，循环eNAMPT水平升高并与MMP-9正相关，且elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor（ETI）治疗后循环eNAMPT降低。体外实验进一步显示，重组NAMPT增加健康供者PBMCs中MMP-9表达和活性。FK866药物抑制降低NAMPT诱导的MMP-9活性及内源性eNAMPT释放，同时在无外源rNAMPT时呈降低基础MMP-9活性的趋势。此外，抑制MEK/ERK通路减弱NAMPT诱导的MMP-9活性，支持ERK1/2信号对该反应的功能性贡献。这些发现支持CF中存在与炎症信号相关的NAMPT–MMP-9轴。然而，现有数据未建立循环eNAMPT水平与肺功能之间的直接关系，也未证明该轴在肺部炎症和组织重塑中的因果作用。尚需在疾病相关模型和更大纵向患者队列中进一步研究，以澄清NAMPT–MMP-9相互作用的机制、确定其与CF相关肺部炎症的相关性，并判断循环eNAMPT是否具有临床生物标志物潜力。