DmRdl第3外显子互斥性可变剪接的调控元件与剪接因子互作网络解析

《International Journal of Molecular Sciences》：Regulatory Elements and Splicing Factors Govern Mutually Exclusive Splicing of DmRdl Exon 3

　　

离子型γ-氨基丁酸（GABA）受体是昆虫中枢神经系统中的主要抑制性受体，其多样性部分由可变剪接产生。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，抗狄氏剂基因（Rdl）第3外显子（E3）的互斥性可变剪接（MEAS）可产生Rdl-3a和Rdl-3b，但其调控机制尚不清楚。在本研究中，研究人员在DmRdl前体mRNA（pre-mRNA）第2外显子（E2）至第4外显子（E4）区域鉴定出两个内含子调控元件（IRE）和一个外显子调控元件（ERE）。IRE1突变使第3b外显子（E3b）纳入率从54.12%降至3.95%，而IRE2突变使E3b纳入率从61.70%升至97.82%。ERE突变在体外和体内均显著提高E3b纳入率，而IRE突变在体内致死。RNA pull-down、质谱（MS）和RNA干扰（RNAi）结果表明，剪接因子CG30122和Rbp1-like结合ERE，并对E3b纳入发挥相反作用。STRING网络分析结果支持CG30122与Rbp1-like之间的功能互作，分子对接为其与含ERE的RNA序列的潜在互作提供了结构支持。该研究揭示了DmRdl E3互斥性可变剪接的分子调控网络，并为研究昆虫Rdl中其他MEAS外显子（如E6和E9）提供了基础。

互斥性可变剪接（MEAS）是指串联排列的替代外显子簇中仅一个外显子保留在成熟mRNA中，从而扩展转录组和蛋白质组多样性。昆虫离子型γ-氨基丁酸（GABA）受体是中枢神经系统主要抑制性受体，抗狄氏剂基因（Rdl）编码其亚基；Rdl第3外显子（E3）的MEAS产生Rdl-3a和Rdl-3b，并可影响受体结构与功能。Rdl还是环戊二烯类（如狄氏剂）和苯吡唑类（如氟虫腈）等杀虫剂的重要靶标。尽管DmRdl E3的MEAS已有报道，其调控机制仍不清楚。已有MEAS调控模型包括空间位阻和竞争RNA二级结构，而RNA-蛋白质相互作用是更普遍的替代剪接调控机制。因此，研究人员系统评估上述模型，并鉴定调控元件和剪接因子。研究结论表明，两个内含子调控元件（IRE）和一个外显子调控元件（ERE）共同控制DmRdl E3的MEAS，CG30122与Rbp1-like结合ERE并发挥相反作用，为昆虫Rdl其他MEAS外显子（如E6、E9）研究及神经受体功能多样性理解提供基础。

关键技术方法概括：研究采用果蝇S2细胞小基因剪接分析（minigene）结合分段缺失、片段替换和定点突变定位调控元件；用逆转录PCR（RT-PCR）和实时定量PCR（RT-qPCR）定量E3a/E3b；用CRISPR/Cas9构建RdlE3a-E4-rep、RdlE3b-E3a-rep和RdlE3bms果蝇品系，果蝇品系来源包括w1118、nos.Cas9（Bloomington Drosophila Stock Center）及TM2 Ubx130/TM6B Tb1（Fungene Biotech）；用RNA pull-down联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）筛选结合蛋白；用RNA干扰（RNAi）进行功能验证；并用GO/KEGG富集、STRING网络和分子对接分析。

2.1 DmRdl前体mRNA中IRE的鉴定。研究人员先预测E3b 5^′剪接位点与分支点距离为1755 nt，超过60 nt阈值；IE3缺失不影响E3b选择，因此空间位阻和竞争RNA二级结构均不被支持为主要机制。随后对E3a-E4内含子分段缺失，定位到片段5，再细分至552，并在16种果蝇序列比对基础上鉴定保守序列CS1、CS2，最终确定IRE1核心6 nt；IRE1替换使E3b纳入率从54.12%降至3.95%。在E3b-E3a内含子分段缺失中，片段1和2影响MEAS，鉴定IRE2为6 nt；IRE2替换使E3b纳入率从61.70%升至97.82%。结论：IRE1和IRE2分别负向和正向影响E3b纳入。

2.2 DmRdl前体mRNA中ERE的鉴定。E3b与E3a互换后E3b纳入率从57.57%降至3.56%，提示E3内存在ERE。将E3b分为五段并以E3a对应序列替换，E3b-Sub1替换使E3b纳入率从63.02%升至81.00%，该区域定义为ERE。结论：ERE参与E3b选择。

2.3 DmRdl E3 MEAS调控元件的体内验证。用CRISPR/Cas9构建RdlE3bms、RdlE3a-E4-rep和RdlE3b-E3a-rep。RdlE3bms纯合体中E3b纳入显著增加，与S2细胞结果一致；RdlE3a-E4-rep和RdlE3b-E3a-rep纯合致死，未进行RT-qPCR。结论：ERE体内调控E3b纳入，IRE1/IRE2极端改变与纯合致死相关。

2.4 RNA pull-down筛选结合ERE的剪接因子。用ERE-WT和ERE-mut探针进行RNA pull-down，银染显示ERE-WT捕获更多蛋白；质谱鉴定343个差异富集蛋白（DEPs，FDR≤0.05，|log₂(FC)|≥1）。GO分析富集于RNA加工、mRNA代谢和RNA结合等，KEGG富集于RNA降解、剪接体、mRNA监视等。交集分析结合hnRNP/SR注释筛选出CG30122、Hrb97D、Rb97D和Rbp1-like作为候选。结论：筛选到潜在ERE结合剪接因子。

2.5 CG30122和Rbp1-like结合ERE调控DmRdl E3的MEAS。RNAi敲低四个候选基因后，仅CG30122和Rbp1-like显著改变E3b纳入：敲低CG30122使E3b纳入率从43.41%降至22.18%，敲低Rbp1-like使从39.19%升至64.13%，二者作用相反。STRING网络显示CG30122与Rbp1-like及yps相关，Rbp1-like连接SmD3、Rb97D、Caper、qkr54B等RNA加工/剪接蛋白。分子对接显示Rbp1-like-ERE与CG30122-ERE模型ERRAT分数分别为90.698和85.235；Rbp1-like与ERE形成5个氢键，CG30122形成3个氢键，结合位点空间相邻但不完全重叠。结论：CG30122和Rbp1-like结合ERE并以相反方式调控E3b纳入。

讨论部分总结：讨论指出，研究结果不支持空间位阻和竞争RNA二级结构作为DmRdl E3 MEAS主要决定因素；IRE1位于E4上游80 nt，可能通过长程RNA-蛋白质复合物促进E3a纳入；IRE2靠近5^′剪接位点，可能通过阻碍U1 snRNP识别抑制E3b纳入，突变后解除抑制；ERE位于E3b 5^′端且邻近3^′剪接受体位点，可能在体内微调E3a/E3b平衡，而非作为二元开关。IRE1和IRE2替换株纯合致死提示精确E3a/E3b平衡对生存重要。CG30122与Rbp1-like对E3b纳入的相反作用，以及ERE整合多RNA结合蛋白效应的特征，与SMN2外显子7、FGFR2外显子IIIb/IIIc及doublesex等系统类似。研究结论：该研究系统鉴定DmRdl pre-mRNA中两个IRE和一个ERE，并用CRISPR/Cas9验证ERE体内功能；RNA pull-down结合RNAi证实CG30122和Rbp1-like结合ERE并调控DmRdl E3的MEAS，为理解重要神经受体转录组多样性及害虫防治靶标提供新见解。