低密度脂蛋白跨内皮转运在动脉粥样硬化中的活化机制与潜在治疗靶点

《International Journal of Molecular Sciences》：Transendothelial Transport of Low-Density Lipoproteins in Atherosclerosis: Mechanisms of Activation and Possible Therapeutic Targets

　　

尽管近几十年来在心血管事件预防方面取得进展，发生动脉粥样硬化及其并发症的风险仍是一项重大挑战。降低该风险的一条有前景途径是开发抑制低密度脂蛋白（LDLs）经内皮活化转运的措施，该过程是动脉粥样硬化的初始阶段。近期研究已提供该机制的一些分子细节，包括caveolin-1（Cav-1）、LDL受体（LDLR）及某些马达蛋白（motor proteins）的作用。本综述总结关于LDL内皮跨细胞转运（transcytosis）研究最新进展的数据，重点讨论其在动脉粥样硬化形成（atherogenesis）中的作用，以及血流动力学、脂蛋白、细胞因子和代谢因素对其的调控。还介绍抑制跨内皮LDL转运的潜在靶点数据。更好地理解内皮LDL跨细胞转运机制并开发抑制该过程的药物，可能促进动脉粥样硬化治疗改善和心血管事件更有效预防。

1. 引言
动脉粥样硬化及其临床表现仍是全球死亡的主要原因，且预计相关死亡率到2050年将增加。对于有临床表现的患者，他汀类药物、危险因素管理及冠状动脉和颈动脉手术可改善预期寿命，但许多患者仍存在动脉粥样硬化进展风险。为降低“残余”风险，研究人员探索使脂蛋白(a)或残粒脂蛋白水平正常化以及靶向血管壁炎症过程等策略。已知低密度脂蛋白（LDLs）跨内皮转运（TET）的局灶性激活在动脉粥样硬化形成中具有关键作用，本综述分析LDL TET机制及其在动脉粥样硬化形成中激活的当前概念，并讨论这些发现应用于医学实践的前景。

2. 动脉粥样硬化形成中LDL跨内皮转运的激活
大动脉内膜及中膜内三分之一的细胞并不通过外膜来源的血管滋养管获取包括脂蛋白在内的营养，而是直接来自动脉管腔。正常内膜细胞数量较少。动脉粥样硬化时LDL自血液进入内膜增加，使内膜中LDL数量超过可消耗它们的细胞数量。LDL颗粒随后通过载脂蛋白B（apoB）正电荷氨基酸残基与细胞外基质中带负电荷糖胺聚糖基团之间的静电作用滞留于内膜，并促进apoB氧化、蛋白水解和糖化等化学修饰。修饰LDL（mLDLs）经多种清道夫受体被内膜巨噬细胞摄取，导致细胞内胆固醇蓄积、泡沫细胞形成及死亡。LDL在内膜蓄积及巨噬细胞反应引发炎症，招募单核细胞和淋巴细胞；持续激活LDL向内膜转运会导致胆固醇蓄积、炎症增强和动脉粥样硬化斑块形成。也有观点认为大动脉内膜LDL蓄积由颗粒在内膜滞留而非LDL TET速率决定；然而LDL TET激活在动脉粥样硬化发展中的重要作用亦被认可。LDL及血浆蛋白通过大动脉内皮最明确的途径是跨细胞转运，但也考虑细胞旁漏的可能。斑块覆盖内皮中可检测到细胞间连接蛋白VE-cadherin的蛋白水解，抑制m-calpain可减缓Ldlr^?/?小鼠动脉粥样硬化进展；部分研究提示死亡或分裂内皮细胞（ECs）区域通透性增加，但尚无研究直接证明LDL经内皮细胞间转运至内膜；球囊剥脱后再内皮化区域出现脂质浸润，而仍缺乏ECs的区域未见脂质浸润，提示LDL通过跨细胞转运机制穿过内皮。支持LDL囊泡转运激活的观察包括：高胆固醇兔主动脉ECs中无衣被囊泡增加并形成多囊泡雏菊样结构和跨细胞通道；Apoe^?/?小鼠易发动脉粥样硬化主动脉区域Cav-1囊泡比例增加；人和遗传性动脉粥样硬化小鼠斑块中Cav-1水平显著增加，ECs特异性敲除Cav1可延迟动脉粥样硬化；LDL跨细胞转运由caveolin而非clathrin包被囊泡介导，并涉及低亲和力LDL受体及促/抗动脉粥样硬化因子影响。

3. 受体及受体后通路在内皮细胞LDL跨细胞转运中的参与
动力学分析显示，即使在低于正常的LDL浓度下，多数LDL颗粒仍经低亲和力受体介导的内吞进入ECs，较少部分经高亲和力LDLR或胞饮进入；高胆固醇血症时经低亲和力途径进入ECs的LDL比例增加。高亲和力LDLR负责向细胞递送胆固醇，其表达受细胞内胆固醇水平严格调控，因而不适合LDL跨细胞转运；该受体基因突变可导致家族性高胆固醇血症和早发动脉粥样硬化。近年来发现ECs中两种LDL低亲和力受体，即清道夫受体B类1型（SR-B1）和激活素受体样激酶-1（ALK-1），二者位于小窝（caveolae）并与LDL共定位。SR-B1为多功能蛋白，是高密度脂蛋白（HDLs）受体、胆固醇及部分脂质跨膜转运体，也是mLDL和凋亡小体的清道夫受体，对天然LDL具有低亲和力；HDL与LDL竞争结合和摄取提示其可能共用结合位点。ALK-1属于转化生长因子β受体家族，经典配体为骨形态发生蛋白9（BMP-9）；LDL与ALK-1结合的解离常数约为200 nM，较LDLR高约30倍，BMP-9与LDL不竞争结合。基因操作改变上述受体表达可相应上調或下调LDL TET；敲低Acvrl1降低LDL和极低密度脂蛋白（VLDL）TET而不降低HDL或氧化LDL转运，缺失Scarb1降低LDL、氧化LDL和VLDL TET。ECs特异性敲除Acvrl1或Scarb1以及给予ALK-1阻断抗体可减缓遗传易感小鼠动脉粥样硬化。SR-B1与LDL作用后其胞质区结合GDP/GTP交换因子DOCK-4，激活Rac1并影响肌动蛋白细胞骨架以促进囊泡转运；ALK-1启动跨细胞转运的机制尚不清楚，但该过程不依赖其激酶域。Rab家族GTP酶调控囊泡运输，Rab4和Rab11可能参与SR-B1和ALK-1回收，Rab10负责LDL从反式高尔基体向基底侧膜转运，Rab6也可能参与；敲低Rab10或Rab6降低LDL而非白蛋白跨细胞转运，提示LDL胞吐存在特异通路。含caveolin囊泡在ECs基底膜的胞吐由SNARE、SNAP和NSF ATPase介导，但这些蛋白是否参与LDL胞吐仍待研究。

4. 动脉粥样硬化中LDL跨内皮转运的调控
4.1 剪切应力
剪切应力是血流动力学变化的主要因素。灌注主动脉和分离ECs研究显示，短期而非长期剪切应力增强LDL通过内皮细胞层；机械感受器可能对流向变化所致的振荡应力而非单一速度和方向的血流作出反应。动脉粥样硬化病变好发于湍流区域，且这些区域Cav1和Scarb1表达增加。振荡应力增加ECs中内源性大麻素受体CB1表达，其激活经Gi蛋白/c-Jun/Cav-1信号增加LDL TET；CB1激活机制、内源性脂质配体N-花生四烯酰乙醇胺（AEA）的作用及其机械感受器角色尚需明确。湍流激活Piezo1、多囊蛋白和连接蛋白37等Ca²⁺通道，Ca²⁺内流可经Ca²⁺-钙调蛋白介导的cdc42 GTPase激活促进LDL等内化。糖萼在机械感知中起重要作用，易发动脉粥样硬化血管区域糖萼变薄，人斑块中可见糖萼碎片；层流增加而湍流降低ECs表面糖萼蛋白表达，后者与振荡流所致促炎激活及基质金属蛋白酶-9活性形式分泌有关。糖萼蛋白及糖组分对LDL TET的影响、特定机械感受器触发的信号事件，以及Klf-2/4、Yap/Taz和Wnt/β-catenin等通路的作用仍不明确。层流而非振荡条件下ECs条件培养基可抑制与LDL大小相近颗粒的跨细胞转运并具抗炎作用，卵泡抑素样蛋白-1（FSTL1）在层流下升高，其抑制LDL TET可能与降低炎症小体活性和BMP-4产生有关。

4.2 高密度脂蛋白
HDLs及其主要载脂蛋白A-1可影响LDL TET，可能通过竞争SR-B1结合实现，但是否涉及HDLs信号效应尚待研究。HDL中与载脂蛋白M相关的鞘氨醇-1-磷酸（S1P）可增强内皮屏障特性：S1P与ECs表面S1P受体1（S1PR1）作用，激活PI3K和Akt，增加Rac1和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，改变肌动蛋白细胞骨架并稳定细胞间连接。提高血浆S1P（包括HDL相关S1P）浓度可降低血管壁对LDL的通透性，并减缓动脉粥样硬化遗传背景小鼠的动脉粥样硬化进展。

4.3 高胆固醇血症
高胆固醇血症影响大动脉内皮对LDL的通透性。实验性高胆固醇兔主动脉ECs中小窝数量增加并形成玫瑰结样结构和跨细胞通道；Ldlr敲除小鼠经抗ApoB反义寡核苷酸处理后血浆LDL胆固醇降低且主动脉对LDL通透性下降。ECs与富含胆固醇的β-VLDL孵育5天导致细胞内胆固醇蓄积并增加LDL和白蛋白跨细胞转运。PCSK9基因过表达小鼠的动脉粥样硬化主动脉中约30% ECs含富perilipin-2脂滴。LDL被ECs摄取后部分在溶酶体内降解，可能与ECs表达的氧化型LDL受体-1（LOX-1）清道夫摄取mLDL有关，且随高胆固醇程度增加；胆固醇以胆固醇酯形式沉积于脂质空泡，甘油三酯也可能参与。高胆固醇血症中LDL TET激活可能与ECs脂滴蓄积有关：ECs特异性敲除脂肪甘油三酯脂酶导致脂滴沉积、eNOS表达和NO产生下降，并可能通过内质网应激激活炎症。脂滴可经中性脂酶或自噬/脂噬清除；斑块中自噬降低的ECs脂质含量更高，oxLDL诱导的自噬受损增加LDL跨细胞转运，刺激脂噬可减少LDL进入血管壁，细胞外囊泡形成也是清除ECs脂滴的途径之一。

4.4 高血糖
糖尿病可影响LDL TET。患者中LDL自血流清除速率增加，可能因颗粒通过内皮加速。体外研究显示高糖浓度通过抑制Cav-1降解增加细胞内Cav-1含量，从而增加LDL TET；葡萄糖进入细胞后减慢去乙酰化酶Sirt6的核质转位，Sirt6经去乙酰化Cav-1将其导向溶酶体。糖尿病时晚期糖基化终末产物通过晚期糖基化终末产物受体（RAGE）-NF-κB信号刺激ECs合成Cav-1，CAV1基因启动子含NF-κB激活元件。

4.5 细胞因子
促炎细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-1β（IL-1β）在肥胖、代谢综合征及动脉粥样硬化斑块中升高，可经NF-κB通路刺激LDL TET，上调编码caveolae蛋白Cav-1和cavin-1的基因。其他研究显示这些细胞因子对LDL TET的影响不伴CAV1表达变化，IL-1β不影响ECs中SR-B1和ALK-1转运体含量；IL-1β可增加ECs中LDLR蛋白水平并借此刺激LDL TET，但其机制尚不清楚，因LDLR基因表达和蛋白稳定性受细胞胆固醇水平负调控。IL-1β还可能激活Rab27a及其效应器JFC1，参与基底膜附近胞吐。与TNF和IL-1β不同，干扰素-γ、IL-6、IL-4及抗炎脂肪因子脂联素不影响LDL TET；IL-6通过增强内皮脂酶合成刺激HDL跨细胞转运。急性期蛋白如C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A增加LDL TET；肥大细胞介质组胺仅在孵育24小时后经H1组胺受体抑制LDL和白蛋白TET。

4.6 雌激素
雌激素可降低女性脂蛋白谱的致动脉粥样硬化性，并影响LDL TET。雌二醇加入冠状动脉ECs可降低LDL跨细胞转运，该效应由雌激素与膜受体G蛋白偶联雌激素受体（GPER）相互作用介导，其激活降低SCARB1表达；男性冠状动脉ECs中SCARB1表达高于女性冠状动脉ECs。

4.7 多重危险因素
上述研究多分别描述单一促/抗动脉粥样硬化因子的作用，而人群通常同时存在多种危险因素，不同因素组合对LDL TET的影响仍未得到回答。

5. 使LDL经内皮屏障转运正常化的有前景靶点
针对动脉粥样硬化中激活的LDL跨细胞转运有三类干预思路：影响低亲和力LDL受体、囊泡通路及LDL转运效应器。最直接的方法是阻断参与LDL跨细胞转运的ALK-1和/或SR-B1；抑制ALK-1可能更有前景，因其主要定位于ECs，而SR-B1也见于巨噬细胞，并且是HDL受体、具有抗动脉粥样硬化功能。已开发可降低LDL TET而不影响BMP-9激活ALK-1信号的单克隆抗体；BMP-9可使ECs质膜ALK-1减少并降低LDL内化，可能开发不激活BMP信号但仍减少LDL内化的BMP-9类似物。然而ALK-1和SR-B1对LDL亲和力较低且特异性似乎不高，仅阻断一种受体可能由其他受体代偿，单受体抑制的强效作用不宜期待；给予抗ALK-1单抗可使Ldlr^?/?小鼠斑块面积减少约50%，内膜apoB含量降低约60%，apoB肽片段或类似物阻断LDL TET也值得研究。第二类思路是阻断细胞内囊泡形成和运输，如Cav-1抑制剂；他汀通过抑制胆固醇合成耗竭膜脂筏胆固醇，降低ECs膜Cav-1定位并增加eNOS活性，但是否影响LDL跨细胞转运尚不清楚；微管抑制剂秋水仙碱已作为抗炎药获批用于动脉粥样硬化治疗，也可能抑制囊泡运输；dynamin、Rab10、Rab27a及SNARE蛋白亦为可能靶点，但该策略缺乏LDL转运特异性。第三类思路是影响调控LDL TET的效应器和信号通路，如机械感受器、内源性大麻素受体、FSTL1/BMP-4，提高HDLs或其组分S1P浓度，以及抑制ECs上RAGE和清道夫受体（SRA、LOX-1等）。此外，将药物靶向递送至动脉粥样硬化斑块至关重要，可利用斑块中合成的炎症分子实现靶向；例如将炎症小体siRNA经含血管细胞黏附蛋白-1肽配体的阳离子脂质体递送至Apoe缺陷小鼠斑块，可减少LDL进入主动脉内膜并抑制动脉粥样硬化发展。鉴定ECs中参与动脉粥样硬化LDL TET的新分子也将促进靶向治疗开发。

6. 结论
LDL通过大动脉内皮的主要机制为由caveolae介导的跨细胞转运。该过程始于LDL与低亲和力受体（至少包括ALK-1和SR-B1）相互作用。阻止ECs内吞囊泡与溶酶体融合并导向跨细胞转运的机制尚需研究；已有研究描述多种Rab蛋白促进含LDL囊泡向基底膜转移。剪切应力、HDLs、高胆固醇血症、高血糖、雌激素及某些细胞因子等参与动脉粥样硬化形成的因素可调控LDL通过ECs的强度。LDL跨细胞转运的受体、囊泡蛋白、Rab、LDL TET效应器及其受体和细胞内信号通路均可作为抗动脉粥样硬化治疗的潜在靶点；同时，将LDL跨细胞转运抑制剂靶向递送至动脉粥样硬化斑块至关重要，该领域仍需进一步发展。