儿童唇裂和/或腭裂中PD-1/PD-L1与CTLA-4免疫检查点通路的细胞及可溶性特征及其临床参数关联

《International Journal of Molecular Sciences》：Checkpoint Pathways in Childhood Cleft Lip and Palate—Associations of PD1 and CTLA4 with Clinical Parameters

　　

唇裂和/或腭裂（cleft lip and/or palate，CL/P）与反复上呼吸道并发症相关，但伴随该缺陷的免疫调节机制仍未充分阐明。本研究旨在表征CL/P患儿中与程序性死亡受体1（PD-1）、程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）相关的细胞及可溶性参数，并分析其与选定临床及血液学特征的关联。这项单中心横断面研究（single-center cross-sectional study）纳入32例CL/P患儿和16名健康儿童作为对照。检测血清可溶性PD-1（sPD-1）、可溶性PD-L1（sPD-L1）和可溶性CTLA-4（sCTLA-4）浓度，并采用流式细胞术（flow cytometry）评估T淋巴细胞（T-lymphocyte；CD3⁺ CD4⁺和CD3⁺ CD8⁺）及B淋巴细胞（B-lymphocyte；CD19⁺）群体中表达PD-1、PD-L1和CTLA-4的细胞百分比。研究人员分析了免疫学与临床参数之间的关系，以及按性别和分娩方式划分的亚组间差异。与对照组相比，CL/P患儿血清sPD-1、sPD-L1和sCTLA-4浓度显著更高，表达这些免疫检查点（immune checkpoint）分子的T和B淋巴细胞百分比也更高（所有情况p < 0.0001）。研究人员观察到选定免疫检查点相关参数之间存在显著关联，包括sPD-1与sCTLA-4呈正相关，以及CD19⁺ PD-L1⁺与CD19⁺ CTLA-4⁺ B淋巴细胞百分比呈负相关。在研究队列中，这些标志物能清楚区分CL/P患儿与健康儿童；然而，研究人员未发现按性别或分娩方式存在一致差异。与对照组相比，CL/P患儿表现出不同的细胞及可溶性免疫检查点相关谱。然而，鉴于样本量有限及研究的横断面设计，上述结果应视为初步结果，并需在更大规模独立队列中确认。

唇裂和/或腭裂（cleft lip and/or palate，CL/P）是常见先天性颅面畸形，全球活产儿中约1–2/1000，欧洲合并发生率约1.6/1000，孤立腭裂相对少见。其发生涉及遗传易感与环境暴露交互作用。CL/P可伴喂养困难、腭咽功能受损、咽鼓管功能障碍、中耳炎及反复上呼吸道感染和住院风险增加，并可造成反复局部刺激、感染和炎症刺激。慢性及反复炎症刺激可影响免疫稳态及激活与抑制信号平衡，但CL/P患儿全身免疫调节特征仍不清楚，程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）相关数据有限，细胞及可溶性检查点参数是否与临床和血液学特征相关亦未明确，因此开展本研究。研究人员开展单中心横断面研究，纳入32例CL/P患儿和16名健康对照，表征PD-1、PD-L1、CTLA-4相关细胞及可溶性参数，并分析其与临床、血液学参数及性别、分娩方式亚组的差异。结果显示CL/P患儿检查点阳性T、B淋巴细胞比例及sPD-1、sPD-L1、sCTLA-4均显著升高，部分检查点参数相关；未见一致性别或分娩方式差异。该研究提供了CL/P患儿免疫检查点相关表型的初步描述，提示需在更大独立队列中验证。

关键技术方法：采用单中心横断面设计，样本来自单中心儿科门诊招募的CL/P患儿（32例，2–17岁）和健康儿童（16例，4–16岁）；采集外周静脉血，EDTA抗凝血用于血常规及多参数流式细胞术（flow cytometry）免疫表型，血清用于可溶性标志物检测。流式检测CD45⁺、CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺及PD-1（CD279）、PD-L1（CD274）、CTLA-4（CD152）表面表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测sPD-1、sPD-L1、sCTLA-4；统计采用Mann–Whitney U检验、Fisher精确检验、Spearman秩相关及受试者工作特征曲线（ROC）分析。

2.1 基线特征及CL/P患儿与健康对照在免疫球蛋白水平、血细胞计数和淋巴细胞亚群方面的差异。通过基线比较和流式细胞术，研究发现两组年龄和性别分布相近，但CL/P组剖宫产更常见、对照组早产史更多、CL/P组出生体重中位数更高；CL/P患儿IgA和IgE显著更低，IgM和IgG无显著差异；血小板、总白细胞和淋巴细胞计数无显著差异；流式显示CL/P组CD45⁺白细胞、CD3⁺ T、CD3⁺ CD4⁺ T及CD19⁺ B淋巴细胞百分比较低，CD3⁺ CD8⁺ T无显著差异。

2.2 CL/P患儿检查点阳性淋巴细胞频率增加及可溶性检查点水平升高：按性别和分娩方式比较。通过流式细胞术和ELISA比较，CL/P组PD-1、PD-L1、CTLA-4阳性CD4⁺、CD8⁺ T及CD19⁺ B淋巴细胞比例显著更高，sPD-1、sPD-L1、sCTLA-4显著更高（均p < 0.0001）；性别分层无显著差异，仅男孩sPD-L1和CD8⁺ PD-L1⁺呈非显著升高趋势；分娩方式分层仅CD19⁺ PD-L1⁺ B淋巴细胞在剖宫产组更高（p = 0.0493）。

2.3 CL/P队列及其亚组中临床、血液学和免疫检查点参数之间的相关性。通过Spearman相关分析，发现年龄、身高、体重强正相关，白细胞与中性粒细胞、红细胞与血红蛋白强相关，年龄和体型与淋巴细胞计数负相关；可溶性标志物彼此正相关，尤其sPD-1与sCTLA-4，sPD-1/sPD-L1与部分CD8⁺检查点亚群正相关，CD19⁺ PD-L1⁺与CD19⁺ CTLA-4⁺强负相关；性别分层模式大体相似；分娩方式分层存在若干共有相关，但出生体重与IgG关系方向相反，剖宫产后sPD-1与sCTLA-4相关更强。

2.4 免疫检查点标志物的探索性ROC分析：CL/P与健康对照及亚组比较。通过ROC分析，在CL/P与对照比较中sPD-1、sPD-L1、sCTLA-4的曲线下面积（AUC）均为1.00，细胞标志物AUC为0.92–1.00，提示本队列内区分明显但属探索性；在CL/P队列内性别和分娩方式区分大多不显著，仅CD19⁺ PD-L1⁺对分娩方式有中等区分（AUC = 0.7085，p = 0.0482），亚组样本小需谨慎。

讨论部分将上述发现与有限既往证据比较：淋巴细胞亚群改变与Timokhina et al.部分一致，但CD8⁺ T和CD19⁺ B结果方向或显著性与该研究不同，讨论认为应结合研究设计、对照、临床特征和免疫表型方法差异解释；IgA/IgE降低仅为描述性，不能解释为临床相关抗体缺陷。Laager et al.和Kurosaka et al.的流行病学证据支持CL/P患儿呼吸道感染住院和中耳炎风险增加，但本研究未系统评估感染史、微生物参数和呼吸道并发症，不能将检查点差异直接归因于反复感染或慢性炎症。检查点阳性细胞增多和可溶性分子升高被解释为表型差异，不能等同于淋巴细胞耗竭、免疫抑制或抑制信号增强；相关性不能证明功能。性别和分娩方式亚组证据有限，剖宫产相关CD19⁺ PD-L1⁺ B细胞差异需谨慎。ROC的AUC = 1.00仅表示样本内完全区分，不是已建立的诊断性能。局限包括样本小、单中心、横断面、围产期特征不平衡、未评估感染和手术史、未做功能和遗传分析，故结果应视为探索性及假设生成性。

研究结论翻译：在CL/P患儿组中，相关性谱以强的生理性发育和血液学关联为主（年龄、身高、体重、白细胞、中性粒细胞、红细胞和血红蛋白）。研究人员还证明了PD-1/PD-L1与CTLA-4轴中免疫检查点的共同调节，包括可溶性标志物之间的相关以及T和B淋巴细胞表型之间的关联。关键相关性在男孩和女孩中相似，提示无论性别如何均存在稳定的关联模式，而按分娩类型分层则显示选定关系存在异质性（出生体重与IgG关系的方向不同，以及剖宫产后sPD-1与sCTLA-4相关性更强）。由于样本量小、单中心设计、横断面设计以及缺乏功能和遗传学分析，上述结果应视为假设生成性结果，并需在更大规模多中心研究中确认。