靶向JAK/STAT信号通路通过抑制STAT3磷酸化减轻HLA-B27转基因克罗恩病大鼠模型回盲部切除术后复发

《International Journal of Molecular Sciences》：Targeting JAK/STAT Signaling Attenuates Postoperative Recurrence in an HLA-B27 Transgenic Rat Model of Crohn’s Disease

　　

术后复发（postoperative recurrence, POR）仍是克罗恩病（Crohn’s disease, CD）患者回盲部切除（ileocecal resection, ICR）后常见并发症，目前尚无获批疗法。本研究旨在利用HLA-B27转基因（transgenic, Tg）大鼠ICR模型研究JAK/STAT通路（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription pathway）抑制预防POR的益处。29只Tg大鼠在12周龄（W12）接受ICR。Tofacitinib（TOFA；15 mg/Kg/day）或安慰剂于W10作为预防性干预给药。通过监测体重、粪便稠度、实施内镜（W15）并评估宏观和组织学评分（W18）来评估疾病范围与严重程度。通过Western blotting和免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）评估回肠STATs磷酸化（phosphorylation of signal transducers and activators of transcription, STATs），同时通过qRT-PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，定量实时聚合酶链反应）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）定量炎症细胞因子表达。在安慰剂治疗的Tg组中，57%大鼠在至少20%吻合口区域出现黏膜溃疡（宏观评分≥2），这与内镜评分≥9相关。相反，仅13%的TOFA治疗Tg大鼠宏观评分≥2，且所有大鼠内镜评分≤9。TOFA减轻黏膜炎症，并降低回肠STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）磷酸化和促炎细胞因子表达。这些发现为进一步研究JAK抑制作为CD中POR潜在预防策略提供了临床前依据。

尽管CD治疗和疾病监测不断进步，80%患者一生中仍需手术；但手术并非治愈性，末端回肠切除后POR风险高。Rutgeerts et al.于1999年的前瞻性队列显示，ICR后一年内73%患者出现内镜复发，而当时仅20%有临床症状；法国REMIND和GETAID两个前瞻性全国队列分别报告回结肠切除后一年内47%和57.6%的内镜POR，GETAID队列中11.3%患者在术后第一年出现临床复发。更广泛地，在缺乏术后预防治疗时，内镜POR在术后第一年影响约四分之三患者，长期超过85–90%，而临床POR可能在切除后5年内发生于约50%患者。POR机制复杂多因素，黏膜/肠系膜免疫系统与肠道微生物群的异常互作、手术技术和环境因素是其关键特征。现有预防策略主要包括内镜引导的药物治疗和术后早期预防，后者常用靶向肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）或白细胞α4β7整合素的药物。近期CD患者回肠转录组分析发现POR相关基因签名，表现为白细胞介素（interleukin, IL）-23和IL-17上调及JAK/STAT通路异常激活。JAK家族由JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四种磷酸转移酶组成；JAK抑制剂已用于IBD，但其预防CD中POR的潜力尚未探索。鉴于JAK1、JAK2和JAK3可协调STAT3磷酸化，而STAT3是POR发病机制中的中心通路，研究人员假设以pan-JAK抑制剂TOFA阻断该轴可改善疾病复发，并在HLA-B27 Tg大鼠中建立ICR及端端吻合模型。研究显示，TOFA降低POR发生率、宏观及内镜病变、组织学炎症、回肠STAT3磷酸化和促炎细胞因子表达，为JAK抑制预防CD术后复发提供了临床前依据。

研究人员采用HLA-B27 Tg大鼠ICR模型；HLA-B27 Tg大鼠由Professor M. Breban（Cochin Institute, INSERM U1016, Paris, France）提供，饲养于Institut Pasteur de Lille。29只年龄匹配、性别混合Tg大鼠随机分为PBS组（n=14，6雄8雌）和TOFA组（n=15，8雄7雌）；TOFA按15 mg/Kg/day（7.5 mg/kg，每日两次）自W10灌胃至W18，W12行3 cm ICR及端端吻合。主要关键技术包括临床参数与疾病活动指数（disease activity index, DAI）监测、W15内镜（Murine Endoscopic Index of Colitis Severity, MEICS）、W18宏观评分（adapted Rutgeerts）定义POR≥2、组织学评分（adapted Geboes）、Western blotting检测pSTAT3/STAT3、IHC定位及计数pSTAT3阳性细胞、qRT-PCR检测细胞因子mRNA、ELISA检测IL-17。

2.1. Clinical Parameters
研究人员每周监测体重、粪便血和粪便稠度并计算DAI。PBS组与TOFA组均无死亡；PBS组ICR后一周（W13）较W12出现显著短暂体重下降（p=0.015），TOFA组体重变化总体相似但W12与W13间无显著差异；未观察到血便，DAI主要反映体重下降和粪便稠度；TOFA维持DAI稳定，但与对照相比无显著差异。

2.2. Macroscopic Anastomotic Lesions and POR at W18
W18宏观评估吻合口病变，PBS组超过90%（13/14）出现宏观吻合口病变，POR（宏观评分≥2）发生率为57%±14%；TOFA组多数（11/15）宏观吻合口正常，TOFA显著降低宏观评分（0，IQR：0–1 vs. 2，IQR：1–2.25；p=0.0002）及POR发生率（13%±9% vs. 57%±14，p=0.02；odds ratio：8.667，95% CI：1.493–46.15）。

2.3. Endoscopic Assessment at W15 and Predictive Value for POR at W18
W15内镜评估末端回肠，TOFA组均为轻度病变（评分≤6，中位6），PBS组病变显著更重（评分≥6，中位9.5）（p<0.0001）；W15内镜严重度与W18宏观病变强相关（r=0.7783，p<0.0001）。以内镜评分9为ROC界值（AUC：0.9069，95% CI：80.13%–100%），高分组POR为8/12，低分组为2/17（p=0.0045）；该界值PPV为66.7%、NPV为88.24%，敏感度80%、特异度78.95%；PBS组85%（12/14）出现评分≥9，TOFA组无评分≥9者。

2.4. Histologic Anastomotic Lesions at W18
W18吻合口组织学分析显示，PBS组12/14存在黏膜糜烂和炎症浸润（评分≥2），中位组织学评分为3；TOFA显著降低组织学评分至2（p=0.03），并显著减少固有层炎症细胞浸润（68×10³ cells/μm² vs. 133.3×10³ cells/μm²，p=0.034）；浸润细胞数与组织学评分显著相关（r=0.732，p<0.0001）。

2.5. STAT Phosphorylation in Ileal Samples at W18
Western blotting检测W18回肠样本，TOFA组pSTAT3/STAT3比值显著降低，中位倍数变化为0.5，而PBS组为1.16（p=0.0023），提示TOFA在体内降低STAT3磷酸化。

2.6. Localization and Quantification of pSTAT3-Positive Cells in Transparietal Anastomotic Samples
IHC评估吻合口全层样本中pSTAT3阳性细胞数量及定位，PBS组阳性染色占总面积的中位百分比由W12的0.036%升至W18的0.061%（p=0.0002），且多数位于固有层，提示JAK/STAT通路在免疫细胞中活化；TOFA组W18降至0.02%（p<0.0001），且TOFA组手术至处死无显著增加。

2.7. mRNA and Protein Expression Levels of Pro-Inflammatory Cytokines in the Anastomotic Area
qRT-PCR显示PBS组吻合口区Tnf、Ifn、Il17、Il23和Il6从W12至W18显著增加，Il1b呈不显著趋势；TOFA显著降低W18时Tnf（62%）、Ifn（58%）、Il17（78%）、Il23（21%）、Il6（68%）和Il1b（59%）的上调。ELISA显示TOFA显著降低脾、肠系膜淋巴结和回肠中IL-17水平（p=0.014、p<0.0001、p=0.006），且脾裂解液中IL-17浓度高于肠系膜淋巴结或回肠。

讨论部分总结认为，POR病理生理尚未完全阐明且循证治疗有限，临床前模型十分必要；HLA-B27/human β₂-microglobulin转基因大鼠可重现IBD及脊柱关节炎关键特征，其多系统炎症主要源于错误折叠HLA-B27重链引起的内质网应激及未折叠蛋白反应，促进IL-23过度产生和Th17型免疫反应，增加IL-17及其他促炎因子表达；该大鼠约10周龄起自发结肠炎，W12 ICR后6周出现吻合口周围回肠水肿、溃疡和狭窄，评分≥2用于定义临床POR。POCER研究提示内镜溃疡对临床POR进展具有预测价值，本研究也发现W15内镜评分与W18宏观评分强相关。GSEA及既往研究提示IL-6/JAK/STAT3和Th1/Th17细胞因子网络参与POR。TOFA靶向JAK1和JAK3的ATP结合位点，降低STAT3磷酸化并调节多种I/II型细胞因子受体下游信号。本研究中残余pSTAT3信号使研究人员无法判断TOFA是部分还是完全抑制STAT3信号，也不能确定残余STAT3活化是否保留特定生物学功能；TOFA是否影响STAT1和STAT6未被直接评估，IL-4/IL-13在基线时未检出，故数据未提供IL-4/IL-13–STAT6轴激活证据；TOFA治疗后HLA-B27大鼠肠道微生物群总体多样性未显著改变，但不能排除共生–致病菌平衡变化的间接贡献。该实验设计不同于临床术后预防场景，提供的是JAK/STAT药理学抑制预防POR的概念验证；TOFA短期耐受性仅有体重和DAI稳定等支持性证据，并非正式安全性评估，尚需血液学、器官毒性、抗微生物免疫及伤口/吻合口愈合研究；TOFA主要作为药理学工具，不能确立JAK抑制剂类效应，其他JAK抑制剂如Upadacitinib可能调节下游信号不同，其是否转化为不同POR效应仍需研究。

研究结论翻译：Tofacitinib（TOFA）于2018年作为中度至重度活动性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）的有前景口服治疗被引入。尽管随后因血栓栓塞事件、心血管并发症和恶性肿瘤风险增加而受到限制，TOFA仍获批用于TNF抑制剂治疗失败或不耐受的UC患者。在本研究中，该实验模型TOFA给药后未观察到重大短期耐受性信号；然而，研究人员观察到接受TOFA治疗8周的HLA-B27大鼠无死亡，包括体重和DAI评分在内的临床参数稳定。此前，研究人员还证明TOFA给药未改变HLA-B27大鼠的微生物群多样性。总之，这些发现支持TOFA在治疗期间在HLA-B27大鼠中耐受良好，与CD中的三项临床试验（一项II期NCT00615199，两项IIb期NCT01393626、NCT01393899）和一项开放标签扩展研究NCT01470599的证据一致。尽管这些发现不能直接外推到临床术后预防，也不确立JAK抑制剂的类效应，但HLA-B27 ICR模型中STAT3磷酸化降低并伴随炎症细胞因子表达下降和肠道病变减轻，进一步揭示POR的炎症机制。这些结果支持进一步开展临床前研究，评估JAK抑制作为预防CD患者POR的潜在策略。