内皮细胞中cohesin减少诱导的染色质重塑重分布全基因组FLI1结合

《Epigenetics》：Chromatin rewiring in endothelial cells upon cohesin reduction redistributes genome-wide FLI1 binding

　　

三维基因组组织对基因调控和细胞身份至关重要。架构蛋白CTCF（CCCTC-binding factor）和cohesin（黏连蛋白）复合物（cohesin complex）介导染色质环化（chromatin looping），塑造细胞类型特异性转录。尽管这些蛋白在胚胎干细胞和其他增殖系统中的功能已被广泛表征，但这些普遍表达因子在终末分化细胞（如内皮细胞（endothelial cells, ECs））中对转录的调控仍知之甚少。此外，由于CTCF和cohesin对细胞活力至关重要，既往研究大多依赖近乎完全耗竭，从而进一步增加了结果解读的复杂性。因此，CTCF和cohesin在分化细胞中以冗余、协同或独立方式调控细胞类型特异性程序的程度仍是一个主要知识空白。为解决这一问题，研究人员在人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）及iPSC来源内皮细胞（iPSC-derived endothelial cells, iEcs）的同基因系统中，将CTCF或cohesin核心亚基RAD21蛋白水平降低至约50%，从而实现未分化与谱系定向细胞状态之间的直接比较。CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）和RNA测序（RNA sequencing）显示，部分耗竭后，CTCF和RAD21在基因启动子上的占据出现显著且EC特异性的丢失；RAD21减少对内皮基因表达的影响较CTCF耗竭更明显。RAD21丢失还导致FLI1（Friend leukemia integration 1）结合显著重分布，而FLI1是对内皮身份和功能至关重要的转录因子。总之，研究人员的发现突显了RAD21通过协调控制染色质架构和调节转录因子占据，在内皮细胞特异性基因表达中的关键贡献，为cohesin依赖的血管转录程序调控提供了机制性见解。

三维基因组组织是基因表达和细胞身份的基本调控因素，拓扑关联结构域（topologically associating domains, TADs）及其内部亚TAD和染色质环（chromatin loops）将增强子与靶启动子空间靠近，并隔离非匹配远端增强子，从而支持细胞类型特异性转录。CTCF（CCCTC-binding factor）和cohesin（黏连蛋白）复合物是这些高级结构的主要调控者，且对细胞活力必不可少。既往研究已在胚胎干细胞和增殖系统中广泛表征二者功能，但在终末分化细胞如内皮细胞（endothelial cells, ECs）中，二者如何调控细胞类型特异性程序仍不清楚；同时，完全耗竭会因细胞致死性干扰结果解读，CTCF与cohesin在分化细胞中是冗余、协同还是独立发挥作用仍是知识空白。基于此，研究人员在人iPSC系039B及其iPSC来源内皮细胞（iPSC-derived endothelial cells, iEcs）同基因系统中，将CTCF或cohesin核心亚基RAD21降至约50%蛋白水平，以比较未分化与谱系定向状态，并结合CUT&Tag、RNA测序（RNA sequencing）、Micro-C及公共数据，发现iEcs中启动子占据对CTCF/RAD21部分缺失更敏感，RAD21对 endothelial 基因表达影响更强，并揭示RAD21通过维持染色质架构和调节FLI1占据支持内皮转录程序。该研究将cohesin功能从经典结构维持拓展至谱系特异性转录调控，为cohesin依赖的血管转录程序及cohesin功能障碍相关血管疾病提供了机制线索。

关键技术方法概括（≤250字）：研究人员在人iPSC系039B及其分化iEcs中，用慢病毒shRNA分别将CTCF或RAD21降至~50%，并以原代HUVEC（human umbilical vein endothelial cells）用同源shRAD21验证；采用CUT&Tag检测CTCF、RAD21、FLI1、H3K27me₃、H3K4me₃、H3K27ac、H3K4me₁和IgG，结合RNA-seq及RT-qPCR/Western blot；分析Liu et al. 2024的iEC Micro-C、4D Nucleosome的iPSC Micro-C及Nora et al. 2017的mESC CTCF ChIP-seq/Hi-C公共数据；并用随机森林（Random Forest）模型预测环维持。

研究结果：
（1）CTCF/RAD21差异调控细胞类型特异性基因表达（CTCF/RAD21 differentially regulated cell-type-specific gene expression）：RNA-seq、RT-qPCR和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）显示，RAD21耗竭对iEcs和iPSCs基因表达影响均大于CTCF；两种细胞中CTCF或RAD21差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）重叠很少。CTCF耗竭在两类细胞中激活炎症并扰乱细胞周期，且在iEcs中独特抑制代谢和应激耐受；RAD21耗竭广泛抑制炎症通路，并在iEcs与iPSCs中对TGF-β和上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）产生相反影响，iEcs中血管生成、糖酵解和Notch信号相关基因集富集降低。结论是二者以细胞类型依赖方式并可调控独立基因表达程序。
（2）CTCF/RAD21结合动态编排iEC特异性染色质架构（CTCF/RAD21 binding dynamics orchestrate iEC-specific chromatin architecture）：CUT&Tag显示耗竭后iEcs中CTCF和RAD21结合位点大量丢失，仅少量新获得；启动子区域受影响最显著，而iPSCs中丢失在启动子和非启动子间更均匀。基序分析显示丢失位点富集SRSF1基序；iEcs中RAD21丢失位点富集FLI1和NFYA等内皮相关转录因子基序。结论是CTCF/RAD21在分化iEcs中更关键地维持启动子架构，并提示RAD21与内皮身份调控相关。
（3）RAD21耗竭降低CTCF-RAD21共享位点之外的启动子占据（RAD21 depletion diminishes promoter occupancy beyond CTCF-RAD21-shared sites）：全基因组占据重叠显示约65% CTCF位点共占RAD21，共享位点富集于启动子；耗竭后各自唯一启动子位点占据下降，RAD21丢失影响更明显，其唯一RAD21启动子位点降至25.1%（对照43.4%，CTCF-KD 44.3%），而唯一CTCF位点变化较温和；该现象在iPSCs中不明显。结论是iEcs中RAD21对启动子占据的维持更突出且具细胞类型特异性。
（4）CTCF/RAD21染色质环选择性组织启动子与不同基因组元件的接触（CTCF/RAD21 chromatin loops selectively organize promoter contacts with distinct genomic elements）：基于Micro-C环锚分析，RAD21丢失呈较对称破坏，丢失一个或两个锚点的环数相近；CTCF丢失主要影响一个锚点。许多环在部分耗竭后仍保留结合，且双保留或双丢失环富集，非对称丢失少于随机预期，提示二者在环锚维持上协同。随机森林模型预测iEcs中CTCF和RAD21耗竭后环分别减少约35.1%和41.8%，iPSCs中约22%和18%。RAD21敏感环富集启动子相关相互作用，CTCF更偏向启动子-启动子环；CTCF耗竭相关DEGs以上调较多，RAD21耗竭以下调较多。结论是二者协作维持环结构，RAD21更支持启动子-增强子样连接和活性转录。
（5）FLI1-RAD21的内皮细胞特异性关联（EC-specific association of FLI1-RAD21）：RAD21耗竭不改变FLI1 mRNA和蛋白表达，但降低TEK、VWF、ENG等FLI1直接和间接靶基因表达；FLI1 CUT&Tag显示其全基因组重分布，结合位点增多，尤其位于内含子和远端基因间区；RAD21丢失位点处FLI1信号最强。连接RAD21丢失启动子与远端FLI1位点的环数量在耗竭前后相近但重叠有限、锚点距离增加；FLI1靶基因更多与下调基因相关，FLI1结合增加基因平均更下调（AUC=-0.202）。HUVEC中RAD21敲低同样不改变FLI1表达而降低其靶基因。结论是RAD21通过稳定FLI1染色质结合及增强子-启动子通讯支持内皮基因表达。
（6）CTCF和RAD21在不同增强子状态下的结合动态（CTCF and RAD21 binding dynamics across enhancer states）：以H3K4me₁-H3K27ac定义活性增强子、H3K4me₁-H3K27me₃定义 poised 增强子、H3K4me₁-only定义 primed 增强子，并在非启动子区鉴定iEC特异性超级增强子（super-enhancer）。CTCF/RAD21丢失位点较保留位点更多重叠超级增强子、活性增强子和poised增强子；RAD21丢失位点与活性增强子和超级增强子重叠比例更高，且RAD21在各增强子类别中保留位点多于CTCF。结论是CTCF/RAD21优先占据并稳定iEC特异性增强子，其丢失可能破坏增强子-启动子架构。

讨论部分总结：该研究将CTCF和RAD21置于未分化iPSCs与谱系定向iEcs中比较，提出CTCF更偏静态边界元件，而cohesin/RAD21更具动态、谱系特异和转录因子协作的调控角色；部分耗竭较完全耗竭更接近生物学相关状态并关联单倍剂量不足。iEcs对CTCF/RAD21介导的启动子架构依赖更强，CTCF/RAD21虽有共享和独特分布，但在环锚维持上协同；部分耗竭对转录影响大于整体环稳定性。RAD21-FLI1轴是核心机制发现，且HUVEC验证支持其在内皮细胞中的相关性；研究还提示CTCF/RAD21维持活性增强子和超级增强子架构。原文同时指出，基于预测模型的结论需直接实验验证，RAD21是直接调控FLI1结合还是继发于更广泛染色质组织改变仍需进一步研究。

结论翻译：总之，该研究表明，尽管CTCF和RAD21均参与整体染色质组织，但二者在塑造内皮基因表达中发挥不同且依赖环境的作用。值得注意的是，研究人员的发现提示，RAD21参与调控iEcs中FLI1依赖的转录程序，可能通过稳定功能性染色质相互作用而非改变FLI1表达实现。这些发现推进了对染色质架构如何与转录因子（transcription factor, TF）网络整合以建立和维持内皮身份的理解，并可能对与cohesin功能障碍相关的血管疾病状态具有意义。