基于LC–MS/MS的木香（Mu Xiang）商品药材安全性筛查与质量标志物定量评估

《Pharmaceuticals》：Safety Screening and Marker-Based Quality Assessment of Commercial Aucklandia costus (Mu Xiang) by LC–MS/MS

　　

摘要 背景/目的： 木香（Mu Xiang）是一种广泛使用的植物药产品，其俗名亦被用于马兜铃属（Aristolochia）物种。马兜铃属含有具肾毒性和致癌性的马兜铃酸，因此误认可能导致木香产品污染。本研究旨在开发并验证一种液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）方法，在一次运行中筛查马兜铃酸I并定量质量标志物木香烃内酯（costunolide）和去氢木香内酯（dehydrocostus lactone）。方法： 采用50%乙醇水溶液进行超声辅助提取，随后使用以乙醇为基础的流动相进行LC–MS/MS分析，所有分析物在4分钟内洗脱。该方法依据国际人用药品注册技术协调会（International Council for Harmonisation）指南进行验证，在木香与马兜铃（Aristolochia indica）的混合样品上进行测试，并应用于来自沙特市场的40份商品木香样品。结果： 马兜铃酸I（检出限0.02 μg/L）在10% w/w马兜铃掺假水平下仍可检出，但在任何商品样品中均未检出。木香烃内酯与去氢木香内酯的总含量范围为0.19%至1.82% w/w，而经鉴定的参比样品为2.10% w/w，仅一份样品达到《中国药典》规定的1.8% w/w最低限度。结论： 马兜铃酸I的缺失并不能保证产品质量。将马兜铃酸I筛查与标志物定量结合于一次运行中，为木香产品提供了一种有前景的质量控制工具，尽管未对其他马兜铃酸同系物进行筛查。

论文解读：木香商品药材的LC–MS/MS安全性筛查与质量标志物定量评估

一、研究背景与问题

木香（Aucklandia costus，又称印度木香或Mu Xiang）是广泛应用于呼吸系统、消化系统及炎症性疾病治疗的药用植物。然而，在传统中医药体系中，“木香”这一俗名亦被用于若干植物学上无关的物种，其中包括某些马兜铃属（Aristolochia）物种。马兜铃属植物含有马兜铃酸，尤其是马兜铃酸I（aristolochic acid I, AA-I），这是一种天然存在的硝基菲羧酸，具有明确的肾毒性和致癌性。暴露于马兜铃酸是慢性肾病（包括马兜铃酸肾病）的主要风险因素，并与尿路上皮癌及多种恶性肿瘤的发生密切相关。由于名称混淆导致的误认、替代或掺假，使得木香商品药材面临潜在的马兜铃酸污染风险。尽管欧美监管机构已采取措施，但马兜铃酸暴露问题仍持续存在，主要归因于植物药产品监管不足。

DNA条形码等分子鉴定方法在加工、粉末化或提取后的药材中效果有限，因为DNA降解会影响聚合酶链式反应扩增。因此，化学标志物的鉴定对于评估药用植物的身份、安全性和质量仍然至关重要。木香的疗效和质量主要与其倍半萜内酯类成分相关，特别是木香烃内酯（costunolide, CO）和去氢木香内酯（dehydrocostus lactone, DC），二者被广泛认为是该生药及其制剂的质量标志物。已有研究虽曾用高效液相色谱（HPLC）分离上述分析物，但未进行方法验证，且分析时间长达50分钟，使用乙腈等环境不友好溶剂。因此，亟需一种快速、绿色、经验证的集成方法，同时实现安全性筛查与质量定量。

二、研究内容与结论

研究人员开发并验证了一种基于LC–MS/MS的快速分析方法，采用多反应监测（MRM）模式，以乙醇为唯一有机溶剂，在一次4分钟等度运行中同时筛查马兜铃酸I并定量木香烃内酯和去氢木香内酯。该方法经验证后应用于经鉴定的木香参比样品、故意掺入马兜铃（Aristolochia indica）的阳性对照样品，以及来自沙特阿拉伯东部省达曼和科巴尔地区40家草药店的40份商品木香粉末样品。研究结果表明，该方法灵敏度高、精密度好、准确度可靠，且环境友好性优于既往以乙腈或甲醇为溶剂的方法。在40份商品样品中均未检出马兜铃酸I，但仅一份样品达到《中国药典》规定的木香烃内酯与去氢木香内酯总含量1.8% w/w的最低限度，表明安全性筛查通过并不等同于质量合格。该研究首次实现了在一次运行中同时完成马兜铃酸I筛查与两种质量标志物的定量，为木香类产品的质量控制提供了新的技术工具。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：超声辅助提取（以50%乙醇水溶液为提取溶剂，100 mg粉末加入10 mL溶剂，25 °C超声5分钟）；液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）分析，采用三合一四极杆质谱仪，在MRM模式下同时监测每个分析物的一个定量离子和两个定性离子；方法验证遵循国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q2(R2)指南，涵盖专属性、线性、准确度、精密度、检出限（LOD）和定量限（LOQ）；绿色化学评估采用Analytical Eco-Scale、GAPI、AGREE和BAGI四种工具。样本来源为沙特阿拉伯达曼和科巴尔地区40家草药店随机采购的商品木香粉末，以及经鉴定的木香参比样品和马兜铃参比样品。

四、研究结果

4.1 色谱分离与质谱检测

在优化的等度条件下，以含0.1%甲酸和5 mM甲酸铵的乙醇–水流动相实现了三种分析物的基线分离：马兜铃酸I约在1.42分钟洗脱，木香烃内酯在2.62分钟，去氢木香内酯在3.03分钟。马兜铃酸I主要以铵加合物[M + NH₄]⁺形式被检测，而木香烃内酯和去氢木香内酯以质子化离子[M + H]⁺形式监测。所有含分析物的样品均满足鉴定标准，保留时间偏差在±0.1分钟内，定性离子与定量离子峰面积比与标准品的偏差在±30%以内。

4.2 线性、灵敏度、精密度与准确度

各分析物在各自工作范围内均呈现良好线性，决定系数（R2）均大于0.999。马兜铃酸I的检出限为0.02 μg/L，定量限为0.05 μg/L；木香烃内酯的检出限为0.52 μg/L，定量限为1.58 μg/L；去氢木香内酯的检出限为0.92 μg/L，定量限为2.79 μg/L。方法精密度以日内和日间相对标准偏差（%RSD）表示，所有分析物均低于3%。在预提取基质中的回收率为89.7%至100.9%。

4.3 超声辅助提取的溶剂选择

在测试的多种溶剂中，50%乙醇水溶液对马兜铃酸I的提取效率最高，纯水提取效率较低，这可能与马兜铃酸I水溶性有限及植物组织中分析物与基质成分的相互作用有关。提取时间（5–40分钟）和温度（25–60 °C）对提取量无显著影响，故保留5分钟、25 °C的条件。

4.4 马兜铃酸I作为掺假和误认的指示标志

在纯马兜铃中马兜铃酸I含量为0.250% w/w，在50%、25%和10% w/w掺假水平下分别为0.126%、0.063%和0.026% w/w，对应预期稀释值的101–102%。即使在最低测试掺假水平（10% w/w）下，马兜铃酸I仍可被明确检出。根据粉末中的检出限约1.0 μg/g及所用马兜铃中马兜铃酸I含量2500 μg/g推算，理论上可检出低至约0.04% w/w的掺假水平。

4.5 商品样品市场监测

40份商品样品中均未检出马兜铃酸I（粉末中检出限约1 μg/g）。商品样品中木香烃内酯平均含量为0.70%，去氢木香内酯平均含量为0.47%，总标志物含量平均为1.17%，均显著低于经鉴定参比样品的相应值（0.92%、1.18%和2.10%）。样品间变异系数约为28–33%，约为方法精密度（<3% RSD）的十倍。仅一份样品（MX-20，1.82% w/w）达到现行《中国药典》规定的1.8% w/w总含量最低限度；31份样品达到2000年版规定的0.60%木香烃内酯最低限度。一份样品（MX-29）呈现异常图谱，木香烃内酯极低（0.04%）而去氢木香内酯可测（0.14%），DC/CO比值达3.27。

4.6 绿色性与实用性评分

AGREE评分为0.61，属中等绿色范围；GAPI图谱显示三个绿色、七个黄色和五个红色区域；Analytical Eco-Scale评分为87，超过75分的优秀绿色分析阈值；BAGI实用性评分为80，表明该方法具有良好的实际应用性。

五、讨论与结论

该研究将马兜铃酸I筛查与两种倍半萜内酯质量标志物的定量结合于一次4分钟运行中，解决了木香产品长期存在的马兜铃属污染问题。使用乙醇替代乙腈或甲醇作为唯一有机溶剂，符合绿色分析化学原则。马兜铃酸I的检出限（0.02 μg/L）处于文献报道的较低端。在40份商品样品中未检出马兜铃酸I虽令人欣慰，但40份样品全阴性结果与真实流行率最高约7%（单侧95%上限）相符。质量数据显示倍半萜内酯含量在产品间差异显著且普遍低于参比样品，表明毒性污染物缺失并不自动保证产品质量。该方法对监管实验室和质量控制具有应用潜力，但研究存在局限性：安全性筛查仅限于马兜铃酸I、未直接评估天然基质效应、市场调查局限于单一地区和单一时间段。研究结论指出，安全性筛查与定量标志物分析相辅相成，共同为药用植物材料的质量控制和市场监测提供客观依据。