《Biomolecules》：G-Quadruplexes at the ‘Interface’ of Transcription and Alternative Splicing
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DNA和RNA G-四链体（分别为G4s和rG4s）是转录和剪接的已知调节因子。G4s富集于转录活跃的染色质结构域，这些结构域产生易发生选择性剪接（AS）的转录本，至少在高等脊椎动物中如此。这些结构域毗邻核斑（NSs），后者储存关键的AS调节因子。近期研究发现
DNA和RNA G-四链体（分别为G4s和rG4s）是转录和剪接的已知调节因子。G4s富集于转录活跃的染色质结构域，这些结构域产生易发生选择性剪接（AS）的转录本，至少在高等脊椎动物中如此。这些结构域毗邻核斑（NSs），后者储存关键的AS调节因子。近期研究发现揭示了共转录AS的新方面，强调了瞬时rG4s的优势，并揭示了过量rG4s与疾病之间的联系。在此，研究人员讨论(r)G4s据称促进活跃染色质处液-液相分离（LLPS）的能力及其对转录和剪接双重调节因子的亲和力，如何使它们处于NSs与其相关染色质结构域之间通讯的前沿。研究人员还讨论NS组分可能如何有助于维持平衡的(r)G4折叠，提供失衡的实例，并分析基于G4的AS重编程前景。
1. 引言（Introduction）
该综述指出，G-四链体（G4s）和RNA G-四链体（rG4s）是富含鸟嘌呤的DNA和RNA中形成的非经典结构，其折叠关键要求为存在G3+串联并由短环分隔，鸟嘌呤残基通过Hoogsteen键形成G-四分体并堆叠，可结合金属阳离子，其拓扑和相互作用组具有独特性。G4s富集于启动子、增强子、绝缘子等转录相关区域，可阻断RNA聚合酶II（Pol II）、稳定R-loop并招募转录因子（TFs）和染色质重塑因子；rG4s富集于外显子/内含子边界，并与异质核核糖核蛋白（hnRNPs）和富含丝氨酸/精氨酸剪接因子（SRSFs）等AS调节因子相互作用。多数(r)G4s因解旋酶和竞争性二级结构而呈瞬时性，其局部效应依赖位置和上下文；总体上G4s与转录激活相关，并见于活跃、超级增强子支配的GC丰富拓扑关联结构域（TADs）。高等脊椎动物AS精确调控需要从核斑（NSs）及时招募调节因子，GC丰富活跃TADs与NSs空间接近，可称为核斑相关结构域（SPADs）。该综述聚焦NSs与SPADs之间狭小空间“界面”，讨论(r)G4s在其中的作用及基于G4的AS重编程前景。
2. 核斑、活跃染色质与G-四链体的时空重叠（Spatiotemporal Overlaps Between Nuclear Speckles, Active Chromatin and G-Quadruplexes）
2.1 含GC丰富等条带的活跃染色质结构域与核斑相关（Active Chromatin Domains with GC-Rich Isochores Are Associated with Nuclear Speckles）
SPAD概念源于细胞学距离测量技术，尤其是基于酪胺信号放大（TSA）的TSA-seq，可在微米尺度将测序读段密度转换为与NSs的距离；染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）或靶向切割及转座酶标记（CUT&Tag）也可基于NS蛋白相互作用组映射SPAD，但不如TSA-seq适合空间生物学。TSA-seq已在多种人类细胞系及小鼠胚胎成纤维细胞中应用，SPAD在活跃TADs附近且边界不完全重合；CUT&Tag提示胚胎发生中SPAD早于TAD出现，NSs可能不仅适应而且参与塑造3D染色质。TSA-seq映射的SPADs以转录活跃常染色质为主且GC含量高，提示SPADs及其转录本中可能存在G4s和rG4s等GC等条带特异二级结构。
2.2 G-四链体富集于活跃染色质结构域及相关转录本（G-Quadruplexes Are Enriched in Active Chromatin Domains and Related Transcripts）
G4s在活跃TADs及rG4s在TAD衍生转录本中的富集已由多种映射技术支持。G4-seq基于聚合酶停止 assay 反映双链DNA中G4折叠潜力，但不涵盖核小体占据和细胞类型特异表观标记；G4特异性抗体结合ChIP-seq和CUT&Tag已用于不同细胞和谱系，显示G4与活跃染色质标记共定位并在启动子和增强子中富集。rG4映射中，rG4-seq基于逆转录酶停止，提供潜在而非既定结构图谱；二甲硫酸盐（DMS）足迹及其现代变体如MaP-seq可验证rG4，并已确认部分SPAD衍生治疗相关rG4。G4-RNA特异性沉淀测序（G4RP-seq）通过交联固定瞬时rG4并用G4特异性小分子探针富集，支持rG4折叠与转录本G丰富性及编码DNA中G4折叠相关。总体支持活跃SPADs存在rG4丰富转录本，但应强调其瞬时性。
2.3 瞬时G-四链体可能存在于G期和S期核斑附近（Transient G-Quadruplexes Are Likely Present near Speckles in G and S Phases）
多数(r)G4s寿命较短，商业抗体难以区分RNA和DNA结构，RNase处理及选择性稳定小分子可部分解耦G4和rG4贡献。G4比例在M期近零、G0至G1增加、S期达峰、G2下降；S期特异G4必须瞬时以免阻碍复制叉，并与复制起点相关G4不同。启动子、增强子和非翻译区（UTRs）G4可贯穿G期微调转录，启动子G4折叠由染色质背景预设并先于转录起始，UTR G4可受R-loop和G-loop等杂交结构调节。活跃TADs在G1早期形成、G1晚期达最大绝缘并在G2增强分离；SPAD动态大致是TAD和NS动态的卷积，NSs在间期较稳定、M期因SR丰富核心组分超磷酸化而解聚。总体上，启动子/增强子G4及部分UTR G4可能在间期开始即存在于SPADs，其与NSs时空接近是G4参与NS定位或染色质组织假说的重要前提。
3. 核斑相关活跃染色质处G-四链体依赖性生物凝聚体（G-Quadruplex-Dependent Biocondensates at Speckle-Associated Active Chromatin）
3.1 转录生物凝聚体在核斑相关染色质处形成（Transcriptional Biocondensates Form at Speckle-Associated Chromatin）
长而多价增强子（超级增强子）使SPADs将TFs和染色质重塑因子积累至液-液相分离（LLPS）所需临界浓度，形成由含溴结构域蛋白BRD4装饰的高乙酰化启动子和增强子上的动态蛋白枢纽。转录起始前，中介体连接BRD4和辅助激活因子与非磷酸化（无活性）Pol II及主要TFs；中介体、BRD4及含锌指结构域TFs通过内含无序区（IDRs）发生瞬态多价相互作用，非特异IDR接触与溴结构域、锌指等特异相互作用共同维持凝聚体。凝聚体成核需要同时招募多个TFs，超级增强子可同时接触多个启动子，cohesin介导DNA环挤出并以CTCF标记边界，增强子RNA可并入凝聚体。高灵敏新生转录测序、基因表达帽分析、超分辨成像、光转换追踪、荧光漂白恢复及免疫荧光联合DNA荧光原位杂交等证据支持部分SPADs作为生物凝聚体形成支架；关键证据多来自小鼠胚胎干细胞，但瞬态蛋白簇在分化后持续并与分化人类细胞相似，提示该模型可能适用于多细胞系和物种。
3.2 G-四链体协助组装转录凝聚体（G-Quadruplexes Assist in Assembling the Transcriptional Condensates）
G4s在启动子和（超级）增强子中的富集已较明确，但G4s和rG4s通过增加启动子DNA和增强子RNA多价性促进生物凝聚体形成 recently 才被认识。其部分归因于对含溴结构域或锌指结构域染色质重塑因子/TFs的半特异结合，包括凝聚体支架蛋白BRD4、CTCF及靶向GC盒的SP1。CTCF招募至G4s可促进染色质环化，G4插入可形成新的3D接触；增强子四链体免疫沉淀提示启动子和增强子G-tracts分子间折叠可介导蛋白非依赖通讯。SP1作用条件依赖，与含G4基序的癌基因启动子和部分癌细胞超级增强子相关，是否招募至G4s或双链GC丰富基序尚待明确，但已在Bcl3癌基因启动子中显示G4依赖性促进凝聚体形成。G4s还可通过π-π和阳离子-π与蛋白IDRs非特异接触。总体而言G4s可能多途径协助组装转录生物凝聚体，但最直接细胞内证据仍有限，外源G4在人工细胞中形成核斑样点，且G4先于转录起始仅在K562细胞中确定。
3.3 G-四链体参与起始和延伸相关凝聚体（G-Quadruplexes Are at Play in Both Initiation- and Elongation-Related Condensates）
超级增强子处LLPS提示NS-SPAD界面可视为两个凝聚体界面，若区分转录（前）起始和延伸凝聚体则为三个凝聚体界面，后者可视为前者成熟。Pol II是（前）起始和延伸凝聚体共有关键组分，其C端结构域磷酸化状态改变共分离偏好和凝聚体内容。按“支架-客户”模型，中介体、BRD4和无活性Pol II是（前）起始凝聚体支架，活性超磷酸化Pol II及FACT等辅助蛋白是延伸凝聚体支架，多数TFs为客户端；支架特征为长IDRs。DNA非经典支架而是凝聚体组装“表面”，但可用sticker-spacer框架描述，SPAD关键sticker包括（超级）增强子和启动子中的经典TF结合位点及G4s；UTR和第一内含子G4是否预折叠并作为（前）起始凝聚体sticker尚属开放问题。内含子和基因间G4簇可类似超级增强子参与耐药相关基因激活；转录起始位点下游G4簇可能主要为rG4和R-loop中共转录折叠G4，编码链G4稳定R-loop形成正反馈，但受解旋酶和NS相关蛋白平衡；rG4可能支持Pol II支架延伸凝聚体。
3.4 核斑与转录凝聚体相互依赖（Nuclear Speckles and Transcriptional Condensates Are Interdependent）
NSs主要支架为SR丰富蛋白，包括近完全无序的SRRM2、SON及SRSFs，后者除SR基序外含RNA识别基序（RRMs），与非编码RNA（主要MALAT1）构成NSs内层核心；其他RNA和小核核糖核蛋白（snRNPs）作为客户端分布于内外层，外层富集hnRNPs并可视为次级支架，其IDRs在氨基酸偏向上更多样。NSs多层组织已由经典原位杂交、免疫染色、免疫印迹及TSA结合质谱确认。外层蛋白可能在NSs和SPADs间穿梭，许多影响转录延伸、终止、前mRNA多腺苷酸化、剪接和运输，hnRNPs兼具转录调节和RNA加工功能，解释延伸凝聚体与NSs通讯。VEnAS数据库支持增强子活性与AS关联，eRNA可招募NS组分或进入NSs；TAF2和CTCF等起始因子或结构蛋白在特定条件下可进入NSs并影响AS，衰老细胞中SRRM2与CTCF聚集体相互作用可致AS重编程。近期提出“核斑靶向基序”（STMs）约30-mer且脯氨酸位置明确；NSs与SPAD生物凝聚体通过外层蛋白交换相互依赖已较确立，且许多外层蛋白是G4/rG4相互作用蛋白，提示(r)G4s参与NS-SPAD通讯。
4. G-四链体与核斑相关蛋白的相互作用（Interactions Between G-Quadruplexes and Speckle-Associated Proteins）
4.1 G-四链体将核斑蛋白招募至转录凝聚体（G-Quadruplexes Recruit Speckle Proteins to Transcriptional Condensates）
SPAD相关转录凝聚体组分如TAF2和CTCF可通过IDRs瞬态相互作用招募至核斑，可能涉及STMs；NS组分招募至转录凝聚体则涉及RRMs与RNA/DNA特异相互作用。RRMs难识别B型DNA和多数非结构单链DNA，但可识别G4s和rG4s，解释部分NS组分尤其hnRNPs调节含G4启动子的转录起始。G4-hnRNP相互作用最初由pull-down结合质谱发现，后由邻近捕获高通量方法如共结合介导蛋白谱（CMPP）确认；KRAS癌基因启动子G4可由hnRNP A1识别。多数hnRNPs以rG4结合著称，UTR rG4尤其重叠内部核糖体进入位点（IRES）者影响翻译，内含子/外显子边界rG4影响剪接体组装和AS。SRSFs较少结合转录（前）起始凝聚体G4，但可能结合新生转录本rG4，因仅SRSF较少的外层与起始凝聚体部分混合，而新生转录本可进入两层。SRSF1结合rG4例子包括ARPC2的5′-UTR IRES调节rG4和C9orf72第一内含子rG4，后者亦与hnRNP A1亲和；多数rG4相互作用蛋白先由pull-down发现，后由eCLIP或PLGPB等高通量邻近捕获确认。
4.2 核斑蛋白在转录凝聚体中解旋G-四链体（Speckle Proteins Unwind G-Quadruplexes in Transcriptional Condensates）
NS蛋白的(r)G4解旋酶样活性仍研究不足。与活跃转录相关的启动子/（超级）增强子G4解旋看似反直觉，但可能促进向有效延伸转变，细节待明。NS蛋白含RRMs和IDRs，可能机制包括：RRMs将G-tracts识别为线性单链而改变折叠平衡；先识别环序列再结合G-tracts扭曲G4几何；RRMs与邻近IDRs识别二级结构并通过IDR侧链破坏核心。比较G4基序与NS蛋白经典线性结合基序可部分验证前两假说；串联RRMs可协同并以不同方向/特异性结合，TDP-43和hnRNP A1为例显示序列与结构特异结合并存。结构特异性与序列特异性可通过比较G4及7-脱氮鸟苷、8-氧代鸟苷等修饰类似物相互作用组判断，但已有高通量研究缺乏NS蛋白聚焦且2-四分体G4热力学稳定性边界复杂。非均匀G-tracts增加拓扑多样性。精氨酸丰富RRM邻近IDRs参与G4识别和解旋，SR和RG/RGG基序见于SRSFs和多种hnRNPs；精氨酸胍基与外侧(r)G-四分体的阳离子-π相互作用可促进解旋，并进一步与(r)G4骨架磷酸二酯键静电接触改变骨架堆积。总之，多种NS相关蛋白因RRMs和IDRs组合而具(r)G4解旋酶样活性，解旋后可能伴随蛋白解离，符合NS-SPAD通讯动态性。
5. G-四链体与核斑蛋白相互作用的剪接相关后果（Splicing-Related Consequences of G-Quadruplex Interactions with Speckle Proteins）
5.1 G-四链体与经典剪接增强子和沉默子共同作用（G-Quadruplexes Act Alongside Canonical Splicing Enhancers and Silencers）
SRSFs和hnRNPs均结合rG4s，提示在内含子边界可能竞争。顺式调控元件常分为内含子剪接沉默子和外显子剪接增强子，但结合的反式调节因子而非位置决定结果；rG4基序在内含子聚集不自动意味抑制剪接，部分顺式位点对SRSFs和hnRNPs亲和力相近，rG4可与替代二级结构和未折叠RNA平衡，导致复杂竞争。人类神经元中已证明内含子rG4在AS中的作用并部分与线性调控位点解耦：氯化钾处理改变膜电位和Ca2+内流，增强G4侧翼外显子跳跃，eCLIP显示含RGG的hnRNP K和hnRNP U积累于钾敏感差异跳跃外显子边界，minigene验证rG4折叠重要性。永生化非癌细胞中，rG4基序主要簇可招募无RGG的hnRNP H和F，后者促进外显子包含且更有效结合折叠rG4；破坏内含子rG4折叠而保留线性G丰富基序促进跳跃，hnRNP H/F敲低或hnRNP置换配体处理亦见类似跳跃。总体rG4s主要经hnRNP介导与经典内含子剪接增强子/沉默子共同作用，部分hnRNP解旋益处可能与翻译而非AS相关，SRSFs作用研究不足，外显子内rG4效应亦上下文依赖。
5.2 过量G-四链体改变核斑并破坏选择性剪接（Excessive G-Quadruplexes Alter Speckles and Disrupt Alternative Splicing）
瞬时rG4s通过招募NS蛋白促进平衡AS而不破坏NS形态；G丰富微卫星扩张所致过量rG4s与显著NS扭曲相关。GGC扩张见于至少六个基因UTR/内含子，引起肌病和神经疾病，开放阅读框内扩张产生毒性聚甘氨酸/聚丙氨酸蛋白，常影响NSs和其他生物凝聚体，例如含聚丙氨酸的PABPN1形成毒性聚集体并通过提取poly-A mRNA破坏NSs。GGC重复RNA常形成非经典环并招募DGCR8等非NS蛋白。G4C2重复在C9orf72内含子1扩张是ALS和FTD最常见遗传原因，通过RNA重复及翻译产物多途径致病；转录本折叠为rG4s、多聚化并促进 recruited 蛋白聚集，RNA聚焦点隔离RNA加工相关蛋白包括NS蛋白，解释AS异常；poly-dipeptides尤其精氨酸丰富者因阳离子-π倾向破坏NSs和其他生物凝聚体。近期显示多个rG4s可重排NS层并将SRSF1招募至C9orf72内含子1，激活隐蔽剪接位点导致扩张重复外显子化，提示部分二肽重复经延伸外显子1经典翻译产生，是rG4驱动SRSF介导AS重编程的罕见但重要例子。
5.3 在剪接增强子内诱导G4形成可实现受控外显子跳跃（Inducing G4 Formation Within Splicing Enhancers Enables Controlled Exon Skipping）
AS重编程用于防止纳入引入提前终止密码子的外显子，如DMD突变所致杜氏肌营养不良；跳过受损或邻近外显子可在剩余外显子保持阅读框时恢复蛋白功能。已用靶向外显子剪接增强子的异源双链反义寡核苷酸及肽-寡核苷酸偶联物实现该策略，四种吗啉代磷酸二酰胺骨架反义寡核苷酸获批用于可外显子跳跃突变患者，但患者覆盖较窄、疗效有限，长期临床获益难定论。为更可靠 distort 剪接增强子，开发了基于rG4的剪接切换策略：反义模块提供特异性，G丰富rG4诱导模块为关键功能单元；类似双模块设计曾将UTR中热力学不稳定2-四分体单分子rG4重排为更稳定强效3-四分体双分子rG4。rG4基DMD剪接切换中，靶序列无需完整四串联G4基序，含多个G-tracts的G丰富模块可导向距反义靶序列至多70 nt的单个G-tract；多G-tracts易多聚化，可用中断G-tracts产生带凸起G4缓解。测试的凸起G4诱导反义寡核苷酸在培养细胞中约80%外显子跳跃、小鼠中近15%，需与传统异源双链反义寡核苷酸直接比较；临床转化依赖递送和骨架优化，2′-OMe修饰有优缺点。总之，在剪接增强子内诱导rG4折叠是有前景但待深入研究的剪接切换策略，需阐明诱导rG4与NS相关蛋白尤其促/抑剪接hnRNPs的相互作用。
6. 结论（Conclusions）
该综述总结(r)G4s对高等脊椎动物转录和剪接调控的潜在贡献，其特色是调控机器在相互依赖的生物凝聚体即NSs和SPADs转录凝聚体中积累。SPADs似富含G4s并产生G丰富转录本形成rG4s；模型系统提示(r)G4s促进转录凝聚体形成及其与NSs通讯，涉及rG4丰富增强子RNA和SPAD衍生转录本在起始和延伸时进入NSs，以及TFs或(r)G4结合外层NS蛋白在转录凝聚体和NSs间穿梭。部分穿梭蛋白解旋G4s和rG4s，可能促进有效延伸和加工转录本翻译。G4s和rG4s如其他顺式调控元件一样以上下文依赖方式招募反式调节因子，但其启动子和内含子关键热点通常分别与转录激活和外显子包含相关。因此，(r)G4s虽非转录和剪接普遍必需，却招募尤其双重调节因子，促进共转录AS并及时响应刺激重编程；这具进化优势，但(r)G4折叠/解旋精细平衡破坏时易致病理。过量(r)G4s如G丰富重复扩张形成者可隔离NS蛋白、改变NS结构并致广泛剪接缺陷，已在G4C2重复扩张神经退行疾病模型显示；相反，在经典外显子剪接增强子内受控rG4折叠可实现剪接切换，已在DMD模型小鼠dystrophin转录本外显子跳跃编程中显示。未来需明确NS蛋白-rG4相互作用的序列和结构决定因素、瞬态与持续/过量rG4对NSs和转录凝聚体的影响，并开发新型rG4去稳定分子以缓解G丰富重复扩张效应。
