山羊精液组分差异调控子宫内膜与系统性免疫反应：基于离体和体内模型的分子证据

《Biomolecules》：Semen Components Differentially Regulate Endometrial and Systemic Immune Responses in Goats: Molecular Evidence from Ex Vivo and In Vivo Models

　　

精液与雌性生殖道之间的相互作用是受精和妊娠建立的关键步骤。在大多数哺乳动物中，授精会诱导子宫产生短暂的炎症反应，但具体是哪种精液成分导致这一现象尚不清楚。利用离体（ex vivo）和体内（in vivo）山羊模型，研究人员检测了精子与精浆（seminal plasma, SP）是否差异性地调控子宫内膜和系统性免疫反应。将山羊子宫内膜外植体与递增浓度的精子或SP共培养0、1、3或6小时。活精子与SP，而非热灭活精子，诱导了快速、剂量依赖且短暂的前炎症反应，其特征为TNFA、IL-1B、IL-6和IL-8的表达升高，同时IL-4和IL-10的转录丰度降低。在体内实验中，发情同步化的母山羊与可育公羊交配后，其血清细胞因子呈现时间依赖性变化，外周血细胞也表现出前炎症反应，而未交配的对照组则未观察到类似变化。从机制上看，精液暴露与子宫内膜中TLR2 mRNA表达的选择性增加相关，而TLR4仅发生微小变化，这表明TLR2可能参与了山羊精液诱导的子宫免疫激活。总之，这些发现表明，精液成分能够使山羊子宫内膜趋向于前炎症状态，并且与TLR2相关信号通路在生殖道免疫调节中的潜在作用相一致。

研究背景与科学问题

妊娠是一个生物学悖论：母体免疫系统必须耐受半同种异体胎儿，同时抵御病原体入侵。这一过程的起始环节是授精（无论是自然交配还是人工授精）时精液与雌性生殖道（female reproductive tract, FRT）之间的早期免疫对话。精液沉积会触发一系列对早期胚胎发育至关重要的免疫事件。虽然大多数哺乳动物（包括牛、绵羊、马、猪、小鼠和人）中都报道过授精后的炎症反应，但究竟是精子的哪一部分——精子细胞本身还是精浆（seminal plasma, SP）——启动了这一级联反应，仍存在争议。在小鼠中，SP被证明可诱导子宫内膜炎症；而在马子宫内膜中，精子可触发炎症反应，但这种反应会被SP减弱。相反，在牛、绵羊、猪和人类子宫内膜中，精子与SP共同促成了前炎症反应，这表明精液组分的免疫学角色存在物种特异性。

山羊是畜牧业的重要组成部分，尤其在干旱和半干旱地区。尽管其经济价值日益凸显，且辅助繁殖技术（如人工授精和胚胎移植）的应用越来越广泛，但山羊FRT对精液的免疫应答仍知之甚少。具体而言，尚不清楚是精子还是SP主导了子宫免疫信号传导，以及这些组分是否涉及不同的Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）介导的通路。解决这些空白对于优化山羊的生育管理策略、减轻交配后子宫内膜炎症以及提高繁殖效率至关重要。

研究目的与结论

本研究旨在利用离体（ex vivo）和体内（in vivo）模型，在生理相关条件下探讨精液组分对山羊FRT（特别是子宫）的免疫调节作用。研究人员假设，精子和SP对山羊子宫发挥不同的免疫调节作用，这可能与TLR2和TLR4信号通路的差异性激活有关。

通过整合离体和体内实验，研究人员首次详细描述了自然交配后短时间间隔内FRT的早期免疫应答。研究发现，活精子和SP均能在子宫内膜中诱导剂量依赖、快速且短暂的前炎症反应，并伴有TLR2 mRNA的显著上调，而TLR4 mRNA基本保持不变。体内评估进一步显示，这种局部免疫反应与血清细胞因子和趋化因子的系统性变化在时间上相关联。这些发现表明，精液成分能使山羊子宫内膜进入前炎症状态，并提示TLR2信号可能参与了这一过程。

关键技术与方法

1. 1.
   离体子宫内膜外植体培养模型：从屠宰场获取处于排卵前期（晚期卵泡期）的健康山羊子宫，采集子宫内膜组织活检样本进行培养。外植体暴露于不同浓度（0, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ 精子/mL）的精子或不同浓度（0, 0.01, 0.1, 1, 10% v/v）的SP中，持续0、1、3或6小时。
2. 2.
   体内自然交配研究：对30只母山羊进行同期发情处理后，其中25只与可育公羊自然交配，5只作为未交配对照。在交配后0、1、3、6、12和24小时采集血液样本。
3. 3.
   基因表达分析：使用定量实时聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR）检测子宫内膜组织和外周血细胞中目标基因（TNFA, IL-1B, IL-6, IL-8, IL-4, IL-10, TLR2, TLR4）的mRNA表达水平。
4. 4.
   蛋白质定量分析：使用山羊特异性酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒定量血清中细胞因子（TNFA, IL-1B, IL-6, IL-8, IL-4, IL-10）的蛋白浓度。

研究结果

3.1 活性精子在山羊子宫内膜中触发快速、短暂的前炎症反应

通过对离体子宫内膜外植体进行剂量效应和时间效应实验，研究人员发现，与未暴露的外植体相比，暴露于活精子的外植体中前炎症细胞因子（TNFA, IL-1B, IL-6）和趋化因子（IL-8）的转录本丰度显著升高，而抗炎细胞因子（IL-4, IL-10）的mRNA表达则显著降低。热灭活精子未能引起上述任何显著的转录变化，表明精子的活性是诱发该免疫应答所必需的。时间进程分析显示，此反应迅速且短暂，在暴露后1小时即开始上升，3小时达到峰值，随后在6小时逐渐消退。

3.2 精浆调节山羊子宫内膜中前/抗炎细胞因子的表达

为了明确非细胞组分SP的作用，研究人员将外植体与梯度浓度的SP共培养。结果显示，SP同样以浓度依赖的方式显著刺激了前炎症细胞因子和趋化因子的表达，同时降低了抗炎细胞因子的表达。时间进程实验证实，SP诱导的反应模式与精子相似，同样在3小时达到峰值。

3.3 交配诱导山羊血清细胞因子谱的时间性变化并刺激外周血细胞的前炎症反应

为了验证离体发现，研究人员对自然交配的母山羊进行了体内分析。与离体观察一致，交配后血清中前炎症细胞因子（TNFA, IL-1B, IL-6）和趋化因子（IL-8）的浓度在3小时后显著升高，6小时达到峰值，并在24小时后逐渐下降。同时，抗炎细胞因子（IL-4, IL-10）出现短暂降低，在24小时恢复到基线水平。未交配的对照组在整个采样期间未观察到显著变化。对外周血细胞（peripheral blood cells, PBCs）的mRNA分析也显示出与血清细胞因子动力学相平行的模式，表明交配引发了协调的系统性免疫应答。

3.4 精液暴露后山羊子宫内膜和外周血细胞中TLR2和TLR4的差异性表达

为了探究分子机制，研究人员量化了离体外植体中TLR2和TLR4的mRNA表达。结果表明，精子和SP均能时间依赖性地显著上调TLR2的表达，在3小时达到最大，而TLR4的表达基本不变。与此一致，来自自然交配母山羊的PBCs也表现出TLR2 mRNA表达的增加，而TLR4表达几乎没有时间变化。这提示TLR2可能在精液诱导的山羊子宫免疫激活中发挥了更为主导的作用。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究的发现与之前在其他物种（如牛）中的研究结果一致，均表明精子活力是诱导子宫内膜炎症的必要条件，且这种炎症反应是物种特异性的。传统上被视为单纯精子载体的SP，现已被证实含有多种生物活性因子（如TGF-β），能够直接与FRT相互作用并诱导炎症反应。体内实验观察到的系统性免疫反应，其峰值（6小时）晚于离体实验（3小时），反映了体内复杂的生理调控过程，包括免疫细胞募集和循环系统参与。这种交配后的炎症反应被认为是一种受控的、功能上必要的生理过程：初期的前炎症阶段有助于清除碎片和组织重塑，并为胚胎着床做准备；随后的抗炎阶段则限制组织损伤，促进修复，为胚胎发育创造一个免疫耐受的环境。在机制层面，研究人员发现TLR2而非TLR4的显著上调，这与牛的研究结果相似，暗示TLR2主导可能是反刍动物的保守特征，可能与它们特有的合胞体上皮绒毛膜胎盘结构有关。然而，研究人员强调，这并不等同于建立了因果关系，TLR2的功能性作用仍需进一步的功能研究来证实，例如鉴定具体的精液源性配体。

研究结论

总之，精子和精浆在山羊子宫内膜中诱导了快速、剂量和时间依赖性的炎症转录反应，其中活动精子比热灭活精子引发的反应更强。自然交配伴随着系统性细胞因子和外周血细胞谱的短暂变化。TLR2的上调与精液诱导的子宫内膜炎症反应在时间上吻合；然而，这些发现并未确立TLR2信号的因果作用，其功能性参与仍有待确定。总体而言，本研究描绘了山羊围孕期精液成分引发的早期子宫内膜和系统性免疫反应的特征。