地方性蜂胶提取物对人黑色素瘤细胞模型选择性细胞毒性的靶向筛选研究

《Molecules》：Targeted Screening Studies on Endemic Propolis Extracts for Selective Cytotoxicity Against Human Melanoma Cells Models

　　

黑色素瘤是最具侵袭性且威胁生命的皮肤癌类型。蜂胶具有多种生物活性，被认为是抗癌疗法中颇具前景的化合物来源。本研究评估了来自尼泊尔、希腊、哈萨克斯坦、乌克兰和格鲁吉亚等地方性区域蜂胶提取物对黑色素瘤细胞系（A375、SK-MEL-3）和正常人皮肤成纤维细胞（BJ）的细胞毒性作用。采用UHPLC-UV-ESI-qTOF-MS/MS进行化学成分表征，同时测定总黄酮和总多酚含量及抗氧化活性。通过测量细胞活力、细胞凋亡（荧光染色和共聚焦显微镜）及caspase-6活性（荧光分析法）评估生物学效应。大多数分析提取物含有黑杨型蜂胶的特征标志物，包括白杨素、松属素、高良姜素、短叶松素-3-乙酸酯以及咖啡酸单酯类化合物，如咖啡酸苯乙酯（CAPE）和1,1-二甲基烯丙基酯异构体。来自格鲁吉亚的三个蜂胶样本对黑色素瘤细胞表现出最强的抗癌活性，同时对正常成纤维细胞显示出低毒性（SI > 1）。这些提取物还表现出高抗氧化活性和较高的多酚含量。凋亡在A375细胞中占主导地位，而SK-MEL-3细胞中坏死更为明显，这与A375细胞中caspase-6活性升高一致。这些结果表明，格鲁吉亚蜂胶可能成为黑色素瘤治疗中进一步研究的潜在候选来源。

黑色素瘤是最具侵袭性和致死性的皮肤癌类型，其发病率在过去几十年显著上升。蜂胶作为一种由蜜蜂产生的树脂状天然产物，具有广泛的生物活性，尤其是其酚类、黄酮类成分赋予的抗氧化、抗炎和抗肿瘤潜力。尽管已有研究报道蜂胶对多种癌细胞具有抑制作用，但不同地理来源蜂胶的化学成分差异极大，其对黑色素瘤的选择性细胞毒性尚缺乏系统性比较。为此，研究人员开展了一项靶向筛选研究，旨在从尼泊尔、希腊、哈萨克斯坦、乌克兰和格鲁吉亚等地方性区域采集的蜂胶样本中，鉴定出对黑色素瘤细胞具有选择性杀伤作用且对正常皮肤细胞毒性较低的候选提取物。研究人员采用超高效液相色谱-紫外-电喷雾四极杆飞行时间质谱联用（UHPLC-UV-ESI-qTOF-MS/MS）对蜂胶提取物进行化学成分表征，并测定了总酚（TP）、总黄酮（TF）含量以及DPPH自由基清除活性和FRAP铁还原抗氧化能力。通过MTT法评估提取物对A375和SK-MEL-3黑色素瘤细胞及正常人皮肤成纤维细胞（BJ）的细胞毒性，计算半数抑制浓度（IC50）和选择性指数（SI）；利用荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）定性评估细胞凋亡与坏死；采用荧光分析法测定caspase-6活性。研究结果表明，格鲁吉亚三个蜂胶样本（GE-OR、GE-Q2和GE-VA1）表现出最强的抗黑色素瘤活性，SI值均大于1，同时对正常成纤维细胞毒性较低。这些样本富含白杨素、松属素、高良姜素、短叶松素-3-乙酸酯及咖啡酸苯乙酯（CAPE）等黑杨型蜂胶特征成分，并具有较高的多酚含量和抗氧化活性。细胞死亡途径分析显示，A375细胞以凋亡为主，SK-MEL-3细胞以坏死为主，且A375细胞中caspase-6活性显著升高。这些发现提示格鲁吉亚蜂胶具有进一步开发为黑色素瘤辅助治疗制剂的潜力。

研究背景方面，黑色素瘤发病率持续上升且现有治疗手段存在局限性，天然产物来源的化学预防和辅助治疗策略受到关注。蜂胶因化学成分多样且具有抗肿瘤活性而成为研究热点，但其抗黑色素瘤活性的地理来源差异和选择性毒性尚不清楚。研究人员通过系统的化学表征和生物学评估，筛选出具有高选择性的格鲁吉亚蜂胶提取物。

研究方法上，研究人员从尼泊尔、希腊、哈萨克斯坦、乌克兰和格鲁吉亚的地方性区域采集蜂胶样本（样本编号：NE-TRI、GR-PA、KA-BO、UK-TA、GE-Q1、GE-Q2、GE-OT、GE-OR、GE-VA1、GE-VA2），其中GE-Q2、GE-VA1和GE-VA2为首次研究。提取物采用70:10（v/v）乙醇-水超声辅助提取。主要关键技术包括：UHPLC-UV-ESI-qTOF-MS/MS化学成分鉴定，Folin-Ciocalteu法测定TP含量，AlCl3比色法测定TF含量，DPPH和FRAP法评估抗氧化活性，MTT法测定细胞毒性并计算IC50和SI，CLSM结合Apoptosis/Necrosis检测试剂盒定性凋亡和坏死，FAM-FLICA荧光法测定caspase-6活性。

研究结果部分涵盖五个方面。化学组成分析显示，大多数提取物属于黑杨型蜂胶，含白杨素、松属素、高良姜素、短叶松素-3-乙酸酯和CAPE等标志物；尼泊尔蜂胶化学特征不同，可能来源于黄檀属植物。总酚和总黄酮含量测定表明，格鲁吉亚样本GE-Q2和GE-OT的TP含量最高，希腊GR-PA和乌克兰UK-TA的TF含量最高。抗氧化活性测定发现GE-OR、GE-Q1和GE-Q2在DPPH试验中活性最强，GE-Q1和GE-Q2在FRAP试验中活性最高，且TP与两种抗氧化指标呈强相关。细胞毒性试验显示，NE-TRI对黑色素瘤细胞活性高但对正常细胞毒性也高（SI<1）；而格鲁吉亚样本GE-OR、GE-Q2和GE-VA1对A375和SK-MEL-3细胞均表现出高细胞毒性和低正常细胞毒性，SI值大于1，其中GE-VA1对A375的SI达3.06。凋亡与坏死定性评估显示，A375细胞经三种格鲁吉亚提取物处理后以早期和晚期凋亡为主，SK-MEL-3细胞中坏死细胞较多，BJ细胞中坏死和凋亡细胞均较少。caspase-6活性测定表明，三种提取物均显著提高A375细胞中caspase-6活性，而SK-MEL-3细胞和BJ细胞中活性较低，与凋亡染色结果一致。

讨论部分指出，蜂胶的抗癌活性可能与其含有的白杨素和CAPE等成分有关，这两种化合物均存在于筛选出的高活性格鲁吉亚样本中。CAPE已被证实通过内在和外在凋亡途径诱导多种癌细胞凋亡，白杨素则可抑制PI3K/Akt和NF-κB通路并激活caspase。统计相关性分析排除了总酚、总黄酮含量与IC50及caspase-6活性的直接关联，提示抗 melanoma 活性取决于特定成分的协同作用而非总量。研究结论为：格鲁吉亚地方性蜂胶提取物（GE-OR、GE-Q2和GE-VA1）对黑色素瘤细胞具有选择性细胞毒性，伴随高多酚含量和强抗氧化能力，且凋亡在A375细胞中占主导、caspase-6活性升高。基于蜂胶已报道的抗黑色素瘤活性和皮肤再生潜力，将格鲁吉亚蜂胶局部应用于黑色素瘤切除术后创面可能是一种有益的治疗策略。