日本猪源大肠杆菌中黏菌素风险管理措施对耐药性的影响及mcr-1携带质粒的基因组特征

《Antibiotics》：Impact of Colistin Risk-Management Measures on Resistance in Escherichia coli from Pigs in Japan and Genomic Characteristics of mcr-1-Carrying Plasmids

　　

背景/目的：黏菌素（colistin）既往在人医学中临床相关性有限，现已成为多重耐药革兰阴性菌感染的最后线抗菌药物之一，并于2017年被世界卫生组织归类为最高优先级极其重要抗菌药物（HPCIA）。在日本，基于风险评估，2018年通过撤销其饲料添加剂指定并将兽医药用限制为二线治疗，强化了黏菌素风险管理措施。本研究评估猪源大肠杆菌（Escherichia coli）中黏菌素销售量与耐药性的变化，并表征携带mcr-1的分离株。方法：对2013—2023年通过日本兽医抗菌药物耐药监测系统（JVARM）从屠宰场健康猪（n=1122）和送检病理检查的病猪（n=1090）收集的2212株大肠杆菌分离株进行抗菌药物敏感性试验。对黏菌素最低抑菌浓度（MIC）≥4 μg/mL的分离株筛查mcr-1至mcr-10。对32株mcr-1阳性分离株进行长读长全基因组测序。结果：病猪分离株中黏菌素耐药率从2017年的52.0%降至2023年的7.7%，而健康猪分离株耐药率在整个研究期间保持≤6.0%。mcr-1为主要移动黏菌素耐药基因。病猪分离株中以ST88、ST100和ST1为主要序列型（ST），健康猪分离株序列型多样性更高。IncI2为优势mcr-1质粒类型，所有IncI2质粒预测为可接合。其骨架与pHNSHP45高度相似；pHNSHP45是2013年从中国猪源大肠杆菌分离株中鉴定的IncI2质粒，保留pil和tra/vir区域，且一般缺乏ISApl1。结论：2018年强化风险管理措施后，病猪分离株黏菌素耐药率大幅下降，支持这些措施的有效性。稳定且潜在可传播的IncI2质粒继续维持mcr-1，凸显维持风险管理措施、确保审慎使用抗菌药物及继续整合表型与基因组监测的重要性。

研究背景：黏菌素（colistin）为阳离子多肽类抗菌药物，对革兰阴性菌具有杀菌活性。在日本，其作为兽药用于猪和牛细菌性肠道疾病、作为饲料添加剂用于牛猪禽以提高饲料效率已逾五十年；在人医学中，由于肾毒性担忧及低毒性替代药物可及，其临床使用曾大幅下降。2010年代早中期，多重耐药革兰阴性菌流行使黏菌素作为最后线治疗选择的重要性显著上升。2015年在食品动物、零售肉和人类肠杆菌目中发现质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，引发对耐药跨细菌种群和生态区室水平传播的担忧。2017年世界卫生组织将包括黏菌素在内的多黏菌素列为最高优先级极其重要抗菌药物（HPCIA）。日本在符合世界动物卫生组织和国际食品法典委员会原则的风险分析框架下实施食品动物抗菌药物耐药风险管理。日本食品安全委员会2017年评估由家畜黏菌素使用所致、经食物传播的黏菌素耐药大肠杆菌（Escherichia coli）总体人健康风险为“中等”；据此，农林水产省于2018年撤销黏菌素饲料添加剂指定，并将兽药黏菌素限制为二线使用，即仅在一线抗菌药物无效时使用。2021年更新评估明确考虑2018年措施后，将总体风险评价为低，并建议继续收集科学证据和监测信息。日本兽医抗菌药物耐药监测系统（JVARM）提供健康与病病食品动物源细菌的抗菌药物销售量及耐药纵向数据，可在现场条件下评价政策干预。除表型耐药监测外，还需表征携带移动耐药决定因子的细菌谱系和遗传平台，因为耐药不仅可通过耐药菌克隆扩增传播，也可通过接合质粒等移动遗传元件在不同细菌宿主间水平转移。mcr基因编码磷酸乙醇胺转移酶，通过添加源自磷脂酰乙醇胺的磷酸乙醇胺基团修饰脂质A，降低外膜净负电荷，削弱带正电黏菌素与脂质A的静电结合并减少膜破坏。IncI2、IncX4和IncHI2质粒是mcr-1传播的主要载体之一。为评价强化黏菌素风险管理措施的效果并指导未来控制策略，本研究旨在：描述2013—2023年黏菌素年销售量和健康猪与病猪源大肠杆菌耐药率；确定耐药分离株中mcr基因分布；表征2021—2023年近期mcr-1阳性分离株的序列型（ST）、质粒复制子、移动决定因子、共定位耐药基因及质粒结构。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员基于JVARM 2013—2023年数据，分析黏菌素销售量，并对2212株猪源大肠杆菌进行抗菌药物敏感性试验和mcr基因筛查，对32株近期mcr-1阳性分离株进行长读长全基因组测序和质粒分析。结果显示，2018年强化风险管理措施后，病猪源大肠杆菌黏菌素耐药率显著下降，健康猪源耐药率持续较低；mcr-1为主要移动黏菌素耐药基因；IncI2为优势mcr-1质粒类型，预测为可接合，骨架与pHNSHP45高度相似并多缺乏ISApl1。该研究支持2018年强化风险管理措施的有效性，同时提示稳定且潜在可传播的IncI2质粒可继续维持mcr-1，强调维持风险管理措施、确保审慎使用抗菌药物并继续整合表型与基因组监测的重要意义。

关键技术方法：基于JVARM监测队列，纳入2013—2023年日本屠宰场健康猪来源1122株和病猪临床送检来源1090株，共2212株大肠杆菌。采用肉汤微量稀释法测定黏菌素最低抑菌浓度（MIC），以≥4 μg/mL判为耐药；对耐药株以PCR筛查mcr-1至mcr-10；对2021—2023年32株mcr-1阳性株进行长读长全基因组测序（WGS），结合MOB-suite进行质粒重建、复制子与MOB分型及预测移动性，AMRFinderPlus检测获得性耐药基因，FastMLST进行ST分型，BLAST Ring Image Generator（BRIG）比较IncI2质粒骨架。销售量数据来自JVARM报告等。

研究结果：
2.1 黏菌素销售量与耐药趋势：销售量数据表明，饲料添加剂黏菌素由2015年22,782 kg有效成分降至2018年起为零；兽药销售量由2017年19,980 kg降至2018年11,831 kg，随后波动并于2023年达14,394 kg。药敏监测显示，病猪源大肠杆菌黏菌素耐药率2015年峰值61.7%，2017年52.0%，2018年35.5%，2023年7.7%；与2017年比例相比，2018年起各年耐药比例均显著降低（双侧Fisher精确检验，p<0.05）。健康猪源耐药率全程为0%—6.0%。该结果说明强化措施后病猪耐药显著下降，而健康猪维持低水平。
2.2 移动黏菌素耐药基因分布：PCR筛查显示，病猪分离株中mcr-1单独321株、mcr-3单独17株、mcr-5单独31株；mcr-1+mcr-3共3株、mcr-1+mcr-5共29株、mcr-1+mcr-9共5株、mcr-3+mcr-5共1株。健康猪分离株中mcr-1单独22株、mcr-3单独2株、mcr-1+mcr-3共1株，未检出mcr-5或mcr-9。病猪分离株亦携带mcr-3、mcr-5和mcr-9，可单独或组合出现；mcr-5主要见于监测早期，mcr-3间断检出；2023年病猪mcr阳性分离株中仅检出mcr-1。少量表型耐药分离株mcr-1至mcr-10阴性，提示染色体机制或所用PCR未覆盖的耐药决定因子。
2.3 近期mcr-1阳性分离株基因组特征：对2021—2023年32株mcr-1阳性分离株（病猪24株、健康猪8株）进行WGS。健康猪分离株ST多样，病猪分离株以ST88、ST100和ST1为主。所有32株中mcr-1均定位至重建质粒序列；IncI2为最常见mcr-1质粒复制子，占病猪24个质粒中的16个及健康猪8个质粒中的8个。病猪分离株另见IncI1、IncX4、IncFIA/IncFIC及IncHI2A相关多复制子质粒。多数mcr-1质粒含与接合转移一致的移动决定因子；24个IncI2质粒均属MOB_P群并保留转移相关区域，未检出额外抗菌药物耐药基因。病猪分离株中mcr-1亦位于非IncI2质粒：38,264 bp IncX4质粒属MOB_P群并携带bla_TEM-1；260,498 bp IncHI2A/IncN/rep_cluster_1088多复制子质粒属MOB_H群并携带aadA1、aadA2、aph(3′)-Ia、cmlA1、dfrA12、sul1、sul3和tet(A)；237,759 bp IncHI2A/rep_cluster_1088质粒属MOB_H群并携带aac(3)-IVa、aadA1、aadA2、aph(3′)-Ia、aph(4)-Ia、bla_CTX-M-14、cmlA1、fosA3、sul2和sul3；189,906 bp IncHI2A/rep_cluster_1088质粒携带aadA1、aadA2、cmlA1和sul3，预测不可移动。该结果说明mcr-1质粒类型多样，IncI2占优，部分大质粒兼带多类耐药基因。
2.4 IncI2 mcr-1质粒比较分析：BRIG比较表明，病猪和健康猪IncI2 mcr-1质粒主要属MOB-suite cluster AA372，与pHNSHP45骨架高度相似，repA、pil基因及tra/vir转移区大体保守；多数质粒缺乏ISApl1。作者指出，该构型符合ISApl1介导获得后丢失一个或两个插入序列拷贝，并使mcr-1-pap2区在已建立接合质粒骨架中稳定。该比较分析说明相关IncI2骨架持续存在并保留接合转移相关遗传特征。

讨论总结：11年监测分析发现，2018年强化国家风险管理措施后，病猪源大肠杆菌黏菌素耐药显著下降，且与停用饲料添加剂黏菌素及将治疗用黏菌素限制为二线同期发生。Usui等证明停用饲料添加剂后三个地理位置不同猪场黏菌素耐药和mcr-1流行均显著下降，支持去除黏菌素选择压力有助于限制mcr-1在农场维持和传播；观察性设计不能确立因果关系。病猪与健康猪耐药时间模式不同，健康猪耐药持续低而病猪干预前高、干预后明显下降；病猪分离株更可能来自接受抗菌药物治疗的动物及受临床选择的致病谱系，治疗实践变化可能对病猪群体影响更大且更易测量；采样框架不同（屠宰场监测与诊断送检）限制两类群体直接比较。尽管表型耐药下降，mcr-1仍为主要移动黏菌素耐药决定因子。IncI2质粒在两类来源中常见，保留接合转移区且一般无额外耐药决定因子；其骨架与2013年中国猪源大肠杆菌pHNSHP45及2008年日本健康猪源pMRY16-002_4高度相似，提示密切相关祖先IncI2骨架可能在猪相关大肠杆菌群体中长期持续和传播。IncI2质粒中ISApl1频繁缺失可能代表mcr-1携带元件演化后期；Snesrud等比较分析提示含一个或无ISApl1拷贝的mcr-1-pap2结构由祖先Tn6330经丢失一侧或两侧ISApl1形成，He等证明成功转座需完整Tn6330；但ISApl1缺失是否提高无黏菌素选择下mcr-1在IncI2质粒上的稳定性尚待实验验证。ST88、ST100和ST1在病猪分离株中占优具有流行病学意义；日本ST88谱系与病猪及广泛多重耐药相关，本研究中所有ST88分离株均携带与猪水肿病相关的Shiga毒素亚型stx_2e及肠毒素基因。病猪mcr-1集中于有限ST，兼容mcr-1阳性致病大肠杆菌克隆传播；健康猪ST多样性更高且IncI2质粒均一检出，兼容IncI2质粒在异质共生大肠杆菌群体中水平传播。作者讨论近期发现的质粒编码毒力减弱因子VafA和VafB在IncI2 mcr-1质粒中检出，提示其除介导黏菌素耐药外可能影响细菌适应度和毒力。除IncI2外，还鉴定到IncHI2A、IncHI2A/IncN和IncX4复制子mcr-1质粒；IncHI2A相关质粒较大（189,906—260,498 bp）并携带多种其他抗菌药物耐药基因，其中一株IncHI2A/rep_cluster_1088质粒同时携带bla_CTX-M-14和fosA3及多种氨基糖苷类、酚类和磺胺类耐药基因，提示mcr-1与其他类别耐药基因物理连锁可经共选择促进持续。局限性包括：后期病猪分离株数减少（2023年39株）降低年度估计精度，疾病发生和诊断送检实践变化可能影响分离株群体；分离株来自常规监测和诊断而非所有猪场的概率抽样，农场水平聚集无法用现有汇总数据处理；全基因组分析聚焦2021—2023年mcr-1阳性分离株，未直接重建长期质粒演化，mcr-3、mcr-5和mcr-9阳性分离株未作基因组表征，其质粒或染色体位置、质粒背景、遗传语境及可能传播途径不能确定；接合潜力由序列特征推断，未用接合试验证实，预测移动类别不应视为表型可转移性的确定证据。2021年日本更新食品安全风险评估在2018年措施持续实施前提下将总体风险归为低，并强调维持当前科学证据和监测；本研究提供与措施后病猪源大肠杆菌黏菌素耐药下降一致的监测证据，同时基因组结果识别出可转移mcr-1的残余库。因此，维持强化风险管理措施和继续减少黏菌素暴露仍很重要，包括通过疫苗、生物安全与改善饲养管理预防肠道病和水肿病，尽可能进行细菌学诊断和抗菌药物敏感性试验，并严格遵守审慎用药原则；监测应继续整合耐药表型与细菌和质粒基因组学，因为稳定接合质粒即使在直接选择降低时仍可能持续和传播。

研究结论（翻译）：基于2013—2023年收集的JVARM数据，本研究检查了猪源大肠杆菌分离株中黏菌素销售量和黏菌素耐药随时间的改变。日本强化国家黏菌素风险管理措施后，病猪源大肠杆菌分离株中黏菌素耐药显著下降，支持这些措施的有效性。尽管研究期间检测到mcr-1、mcr-3、mcr-5和mcr-9，mcr-1为主要决定因子，且是2023年唯一检测到的mcr基因。多数mcr-1位于主要属于MOB-suite cluster AA372的IncI2质粒。这些质粒一般不带额外抗菌药物耐药基因且多数缺乏ISApl1，但保留与接合转移相关的遗传特征。因此，通过可转移IncI2质粒水平传播mcr-1可能促进黏菌素耐药大肠杆菌的持续出现。持续JVARM监测对监测耐药趋势和移动耐药决定因子传播至关重要。进一步工作应聚焦通过疫苗、改善卫生和饲养管理、基于诊断的抗菌药物选择及严格执行审慎用药原则，减少黏菌素治疗需求。