基于UPLC-MS/MS的人发中新型合成、半合成及相关大麻素检测方法的开发与验证

《Molecules》：Development and Validation of a UPLC-MS/MS Method for the Determination of Emerging Synthetic, Semi-Synthetic and Related Cannabinoids in Human Hair

　　

合成大麻素（synthetic cannabinoids，SCs）是一类结构多样且类似物不断涌现的新型精神活性物质（new psychoactive substances，NPSs）。由于其浓度低、代谢迅速且常规方法覆盖不全，其在生物基质中的检测具有挑战性。毛发分析为回顾性暴露评估提供了检测窗口。本研究旨在开发并验证一种超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry，UPLC–MS/MS）方法，用于同时定性和定量检测人发中的26种合成、半合成及相关大麻素，并评估其在真实法医样本中的适用性。研究人员对方法的线性、检出限（limits of detection，LOD）和定量限（LLOQ）、准确度、精密度、基质效应、回收率及过程效率进行了验证，并在冻融和已处理提取物条件下进行了额外的稳健性评估，随后将该方法应用于n = 100份在驾驶证吊销后的法医评估中检测为Δ9-四氢大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）阳性的受试者毛发样本。LOD为1.56–3.13 pg/mg，LLOQ为6.25–12.5 pg/mg，R2 ≥ 0.992；准确度和精密度均符合预定接受标准，而基质效应（ME）、回收率（RE）和过程效率（PE）的平均表现总体一致，但部分分析物在不同浓度水平上存在较大变异。在100份样本中的23份中检出了目标大麻素，共鉴定出14种不同化合物。MDMB-4en-PINACA、9R-HHC-O和ADB-BUTINACA是最常检出的化合物。该方法能够灵敏、可靠地检测毛发中多种新兴大麻素类别，支持针对不断演变的NPS格局持续更新靶向分析面板。

论文解读

一、研究背景与意义

合成大麻素（SCs）是新型精神活性物质（NPSs）中动态演化最为显著的一类化合物。这类物质最初为药理学研究而开发，随后迅速进入非法药物市场，成为大麻的替代品，并不断通过引入新类似物以规避法律管制和常规分析检测。SCs的毒理学意义主要源于其在大麻素受体上的高效力，可导致严重的神经、心血管和精神系统不良反应。据欧盟毒品机构（EUDA）报告，2024年欧洲新鉴定出20种大麻素，其中18种为半合成大麻素，占当年欧盟早期预警系统新报告物质总量的40%以上。这一现状凸显了持续开展分析监测以及开发能够检测不断演化的大麻素谱系的方法的迫切性。

SCs的主要亚类包括吲哚类和吲唑类衍生物，如PINACA、FUBINACA、CHMINACA、CUMYL、MDMB、BUTINACA等系列，以及近年新出现的OXIZID类化合物。非法市场还经历了半合成大麻素的快速扩张，包括六氢大麻酚（HHC）、六氢大麻酚丙基同系物（HHC-P）、四氢大麻酚丙基同系物（THCP）、六氢大麻酚己基同系物（HHC-H）及相关类似物。这些化合物的检测面临诸多挑战：代谢广泛、生物样本中浓度低、新型物质不断涌现且可能未被常规筛查方法覆盖。血液和尿液等传统生物基质主要反映近期用药情况，而毛发提供更长的检测窗口，可在数月时间尺度上实现药物暴露的回顾性评估。SCs常以原形化合物形式在毛发中检出，这有助于鉴定代谢数据有限或缺乏的新兴物质。因此，毛发已成为法医和法医学鉴定中的重要基质，包括慢性暴露评估、戒断监测和驾驶证重新发放程序等。

尽管具有上述优势，合成和半合成大麻素在毛发中的浓度通常极低，基质效应也可能显著影响分析性能。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）凭借其高灵敏度、高选择性和适用于复杂生物基质中多分析物测定的特点，成为此类测定的首选分析技术。已发表的LC-MS/MS方法证明了在毛发中进行灵敏多分析物大麻素测定的可行性，但这些方法在分析范围、目标组成、样品制备和预期法医应用方面存在显著差异。现有方法仍存在若干局限，包括样品制备方案不统一、样本量不同、提取程序和分析面板多样化，且分析面板可能因新型合成和半合成大麻素类似物的持续涌现而迅速过时。因此，尽管UPLC-MS/MS已确立适用于此目的，仍需要更标准化、快速且可更新的毛发合成大麻素分析方法。本研究旨在根据法医毒理学验证的国际指南，开发并验证一种靶向UPLC-MS/MS方法，用于同时测定人发中一组新兴合成和半合成大麻素，并将其应用于罗马Tor Vergata大学法医毒理学实验室因酒驾和/或毒驾被吊销驾照后接受法医毒理学分析的个体毛发样本，以证明其在常规法医案件中的适用性。

二、主要技术方法

研究人员开发并验证了一种基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的多分析物检测方法，靶向人发中26种合成、半合成及相关大麻素。色谱分离采用Waters ACQUITY UPLC H-Class系统，配备Atlantis Premier BEH C18 AX反相色谱柱（2.5 μm，2.1 × 100 mm），以Comedical A1水相和B2有机相为流动相进行二元梯度洗脱，总运行时间11分钟。质谱检测采用Xevo TQD三重四极杆质谱仪，电喷雾电离正离子模式（ESI+），多反应监测（MRM）模式采集。样品制备流程为：约25 mg均质化毛发经三次二氯甲烷洗涤（第三次洗涤液收集分析作为外部污染定性控制），干燥后加入500 μL Comedical M3酸性缓冲提取试剂和5 μL内标溶液（Δ⁹-THC-d3和CBD-d3，浓度0.5 ng/μL），离心后在100 °C热块中密闭孵育1小时以消化角蛋白基质并提取目标分析物。方法验证遵循法医毒理学验证指南，涵盖选择性、特异性、LOD、LLOQ、线性、准确度、精密度、基质效应（ME）、回收率（RE）、过程效率（PE）、残留以及冻融和已处理提取物条件下的稳健性评估。验证完成后，方法被应用于2022年1月至2025年9月期间在罗马Tor Vergata大学法医毒理学实验室收集的n = 100份真实法医毛发样本，这些样本均来自因酒驾和/或毒驾被吊销驾照后接受法医毒理学检测且经确认大麻素阳性的驾驶员。

三、研究结果

3.1 方法验证结果

选择性与特异性： 使用经确认不含滥用药物和精神活性物质的空白毛发评估选择性。在目标分析物和内标的保留时间处未观察到干扰峰。特别评估了含酯分析物在样品制备过程中的潜在转化：空白毛发仅添加9R-HHC-O（300 pg/mg）并经过完整M3处理（100 °C，60 min）后，9R-HHC通道中观察到的信号低于验证LOD（3.13 pg/mg），估计9R-HHC-O向9R-HHC的摩尔转化率上限<1.2%，不支持样品制备过程中发生显著脱乙酰化。Δ⁸-THC与Δ⁹-THC因共享相同监测离子对且±2%保留时间窗口重叠而受到特别关注，在真实样本中观察到同一进样内两个分离色谱峰（7.35和7.50 min），分别对应Δ⁹-THC和Δ⁸-THC。Δ⁹-THC的M+2同位素对9R-HHC通道无显著贡献。残留评估未观察到显著目标分析物信号。

LOD与LLOQ： 基于预定义信噪比标准（LOD：S/N ≥ 3；LLOQ：S/N ≥ 10），通过基质匹配毛发样本系列稀释确定。LOD范围为1.56–3.13 pg/mg，LLOQ范围为6.25–12.5 pg/mg。LOD经三个不同分析日重复测定确认，LLOQ经五次重复分析确认。对于LLOQ为6.25 pg/mg的分析物，该值基于S/N标准而非完全验证的校准下限。

线性： 采用1/x加权最小二乘线性回归，七个基质匹配校准水平（0、12.5、25、50、100、200、400 pg/mg），内标恒定浓度100 pg/mg。五个独立校准曲线的R² ≥ 0.992，所有校准点的回算偏差在?13.72%至+13.92%之间，均满足±15%（LLOQ处±20%）的接受标准。正式校准定量范围为12.5–400 pg/mg，ULOQ为400 pg/mg。

准确度与精密度： 在低（30 pg/mg）、中（80 pg/mg）、高（300 pg/mg）三个QC水平评估，每个水平五个分析日各三次重复。日内精密度为0.81%–7.26%，日间精密度为0.76%–11.98%，合并精密度估计为1.11%–13.66%。准确度（ERR%）范围为?13.74%至+6.17%。所有值均满足预定接受标准（低QC水平CV < 20%，中高QC水平CV < 15%）。

基质效应、回收率与过程效率： 按照Matuszewski等人设计的实验方案，在三个QC水平评估。分析物均值ME范围为88.65%–109.93%，RE范围为85.91%–110.88%，PE范围为89.83%–117.14%。但水平特异性值呈现更宽范围（ME：80.69%–119.13%；RE：81.77%–130.12%；PE：77.80%–129.67%），部分分析物存在浓度依赖性变异。含酯分析物的回收率范围为85.91%–107.65%，证实其在完整M3处理后仍可分析检测。

冻融与已处理提取物稳健性： 三个冻融循环和自动进样器10 °C放置24 h后，所有测得浓度与标称值的偏差均在±15%以内，未观察到不同大麻素类别间的一致性结构依赖性趋势。

3.2 真实样本应用结果

研究人员将验证后的方法应用于n = 100份真实法医毛发样本。研究人群包括80名男性和20名女性，平均年龄35.2 ± 11.3岁（范围15–65岁）。18–40岁人群占总体的65%。86例为头皮毛发（取近根部3 cm段），14例为体毛（胸毛8例、阴毛5例、腋毛1例）。按发色分类：黑色41例、棕色37例、灰色或花白11例、浅色11例。按Δ⁹-THC浓度分类：<0.2 ng/mg共43例，0.21–0.5 ng/mg共38例，0.51–2 ng/mg共13例，>2 ng/mg共6例。

在23份样本中检出至少一种目标分析物（阳性率23%），共产生39次分析物检出，对应14种不同化合物。阳性样本中22例为男性，1例为女性；平均年龄36.0 ± 10.1岁。18例为头皮毛发，4例为胸毛，1例为腋毛，阴毛样本无阳性结果。MDMB-4en-PINACA为最常检出化合物（n = 7例），其次为9R-HHC-O（n = 6例）和ADB-BUTINACA（n = 5例）。9R-HHC、ADB-4en-PINACA和4F-MDMB-BUTINACA各检出3例；5F-Cumyl-PICA、BZO-4en-POXIZID、5F-EDMB-PICA和5F-EMB-PICA各检出2例；4F-MDMB-BUTICA、Δ⁸-THC、BZO-POXIZID和EDMB-PINACA各检出1例。23份阳性样本中，8份含一种目标分析物，14份含两种，1份含三种，即65.2%的阳性样本存在多种目标大麻素共检出。浓度方面，MDMB-4en-PINACA的算术平均浓度为1256.38 pg/mg，ADB-BUTINACA为1103.69 pg/mg，而9R-HHC-O仅为50.97 pg/mg，显示分析物间和样本间的显著浓度差异。阳性检出率与Δ⁹-THC浓度类别相关：0.51–2 ng/mg类别中8/13（61.5%）阳性，>2 ng/mg类别中6/6（100%）阳性，而<0.2 ng/mg类别中仅6/43（14.0%）阳性，0.21–0.5 ng/mg类别中3/38（7.9%）阳性。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究在真实毛发样本中检出的化合物谱系与国际、欧洲和意大利监测系统报告的物质总体一致。MDMB-4en-PINACA、9R-HHC-O和ADB-BUTINACA是最常检出的分析物，反映了国际研究和欧洲早期预警系统记录的物质演化趋势。MDMB-4en-PINACA的优势地位与全球观察一致，自2019年以来已被多项研究确定为全球最常报告的物质之一。ADB-BUTINACA和ADB-4en-PINACA的检出与近期报告记录的其发生率上升相符。9R-HHC-O和9R-HHC的检出与欧洲六氢大麻酚衍生物的日益涌现及其在法医毒理学中日益增长的相关性一致。BZO-4en-POXIZID和BZO-POXIZID的鉴定值得关注，因为POXIZID类化合物是法医毒理学中较新的大麻素结构类型。5F-Cumyl-PICA、5F-EDMB-PICA、5F-EMB-PICA和EDMB-PINACA的较少检出反映了这些化合物在全球毒品市场中的边缘化地位，但它们的检出表明早期世代的化合物仍可能出现在真实法医样本中。阳性样本中多种目标大麻素的频繁共检出提示阳性案例中暴露于多种大麻素的情况相对常见，但由于毛发提供回顾性暴露窗口，这些发现不能确定同时消费或区分单独暴露与使用含多种大麻素产品。研究还观察到目标分析物阳性率在较高Δ⁹-THC浓度类别中更高，但该观察仅为描述性，不构成统计学关联。定量结果的差异不应直接解释为剂量、使用频率或毒理学意义的差异，因为毛发掺入可能因分析物理化性质而异。

研究结论部分指出，本研究描述了一种灵敏的UPLC-MS/MS方法的开发和验证，用于同时检测和定量26种合成、半合成及相关大麻素，包括六氢大麻酚类、PICA、PINACA、BUTINACA、Δ⁸-THC相关化合物、POXIZID类及选定的新兴分析物。该方法表现出令人满意的整体分析性能，具有低pg/mg级别的检出限和定量限，线性、准确度和精密度结果可接受，基质效应、回收率和过程效率的平均表现总体一致（尽管部分水平存在变异），并在所测试的冻融和已处理提取物条件下表现出令人满意的稳健性。将验证方法应用于n = 100份真实法医毛发样本，检出n = 23例阳性案例，共39次分析物检出，对应14种不同分析物。检出的化合物属于多个结构家族，包括PINACA、BUTINACA、PICA、POXIZID和六氢大麻酚衍生物。观察到的化合物谱系与国际、欧洲和意大利近期监测数据总体一致。这些发现证明了所开发方法在法医毛发分析中的适用性，并强调了涵盖既有合成大麻素和新出现的半合成衍生物的多分析物分析策略的重要性。该研究为所研究人群中合成大麻素的发生情况提供了最新概述，支持未来流行病学调查以及针对新型精神活性物质制定更有效的预防和监测策略。