《Cancers》：A Lymphoid-Enriched Spatial Immune Niche Defines an Immunotherapy-Responsive State in Hepatocellular Carcinoma
编辑推荐：
背景：阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗（atezolizumab plus bevacizumab，ATZ/BVZ）是晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的一线治疗方案，然而仅部分患者获得持久临床获益。肿瘤微环境（tumour m
背景：阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗（atezolizumab plus bevacizumab，ATZ/BVZ）是晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的一线治疗方案，然而仅部分患者获得持久临床获益。肿瘤微环境（tumour microenvironment，TME）的空间组织及其与免疫治疗响应的关系尚未被充分理解。方法：研究人员整合单细胞转录组学、空间转录组学、空间蛋白组学及 bulk RNA 测序队列，以刻画与 HCC 免疫治疗响应相关的空间组织性免疫生态系统。利用来自 100 例 HCC 样本的单细胞 RNA 测序数据构建细胞参考图谱，并与来自 12 个组织的空间转录组数据整合，识别出九个共识空间生态位（consensus spatial niches）。结果：生态位 9（Niche 9）代表一种淋巴富集的免疫状态，其特征为 B 细胞、浆细胞、自然杀伤细胞、T 细胞亚群、巨噬细胞及三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure，TLS）相关转录特征的富集。在独立的、具有治疗响应注释的预处理 Visium 队列中的验证显示，免疫治疗响应者中 Niche 9 相关转录活性显著富集，而空间共配准的 51-plex CODEX 蛋白组学分析为其淋巴及免疫富集表型提供了正交的蛋白水平支持。多组学表征进一步揭示了协调的免疫细胞定位、配体-受体相关模式及独特的代谢程序，其中 MEI1 阳性浆细胞表现出增强的分泌及应激适应状态。由 Niche 9 衍生的九基因转录特征与阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗的响应、增强的淋巴免疫特征、较低的肿瘤免疫功能障碍与排斥（Tumour Immune Dysfunction and Exclusion，TIDE）评分以及独立队列中良好的临床结局相关。结论：这些多队列、多组学分析定义了一个空间衍生的淋巴富集免疫程序，并将其分子特征与 HCC 的免疫治疗敏感性联系起来。
**论文解读：肝细胞癌中淋巴富集空间免疫生态位与免疫治疗响应的多组学关联**
**一、研究背景与科学问题**
原发性肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作为其主要组织学亚型，约占原发性肝癌的80%–85%，且多数患者确诊时已处于中晚期，预后不良。近年来，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的出现显著改变了晚期HCC的治疗格局，但疗效仍受限于复杂的肿瘤微环境（tumour microenvironment，TME），包括免疫排斥、异常血管生成、缺氧、血管功能障碍及免疫抑制性细胞状态。血管内皮生长因子（VEGF）介导的异常进一步损害免疫浸润并促进肿瘤免疫逃逸。基于此，阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗（atezolizumab plus bevacizumab，ATZ/BVZ）——联合免疫检查点阻断与抗血管生成治疗——已成为晚期HCC的标准一线治疗方案。然而，持久获益仅限于部分患者，这凸显了定义与治疗响应相关的微环境特征的迫切性。
TME由恶性细胞、免疫细胞、基质细胞和血管组分构成，其空间组织可影响肿瘤进展和治疗敏感性。除免疫细胞丰度外，局部组织的免疫状态可能对有效的抗肿瘤免疫至关重要。三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure，TLS）相关特征即是一种免疫组织形式，并与免疫检查点阻断的改善响应相关。然而，在独立HCC队列中是否存在可重复的空间免疫状态，并保持一致的细胞和蛋白水平特征，尚不清楚。
既往HCC免疫治疗响应研究主要依赖bulk RNA测序、单细胞RNA测序及常规实验方法。尽管这些方法揭示了显著的细胞异质性和免疫相关机制，但无法完全解析肿瘤生态系统的空间组织或情境依赖性细胞互作。空间转录组学在保留组织架构的同时实现局部微环境的转录组-wide表征，可识别具有不同细胞组成、分子程序和功能状态的空间生态位。然而，在ATZ/BVZ治疗的HCC中，空间免疫生态位及其相关分子程序仍未得到充分表征。
**二、研究内容与结论**
针对上述问题，研究人员整合了单细胞转录组学、空间转录组学、空间蛋白组学和bulk RNA测序队列，系统表征了HCC中空间组织的免疫生态系统。首先结合大规模单细胞参考图谱与空间转录组数据，定义了免疫富集的空间状态及其相关分子程序；随后在独立的、具有治疗响应注释的预处理空间多组学队列中评估了Niche 9相关免疫状态，并使用空间共配准的蛋白组学分析提供正交的细胞和蛋白水平验证；最后衍生出空间信息转录程序，并在包含ATZ/BVZ治疗患者的独立队列中评估其与免疫治疗响应和临床结局的关联。
研究得出以下核心结论：第一，Niche 9代表一种可重复的淋巴富集免疫状态，而非数据集特异的聚类模式。第二，在独立预处理空间队列中，Niche 9高区域在响应者中更常见（池化点水平约两倍富集），CODEX数据支持其淋巴富集表型。第三，Niche 9具有TLS相关的分子和细胞特征，包括B细胞和浆细胞富集、B细胞受体信号、淋巴细胞共刺激、趋化因子信号及TLS相关转录程序。第四，MEI1阳性浆细胞表现出增强的分泌适应状态，涉及免疫球蛋白产生、内质网加工、蛋白转运和N-糖基化等程序。第五，基于Niche 9衍生的十基因转录特征（后续通过机器学习精简至九基因）与ATZ/BVZ响应、增强的淋巴免疫特征、较低的TIDE评分及改善的生存期相关。
该研究的意义在于：建立了空间免疫组织与HCC免疫治疗敏感性之间的关联，为将空间定义的免疫状态转化为临床适用的转录组生物标志物提供了分子框架。研究结果提示，空间组织而非单纯的免疫细胞丰度是免疫治疗响应的重要特征，并为个体化免疫治疗提供了潜在的空间衍生分子标志物。
**三、主要关键技术方法**
本研究整合了多种前沿技术方法，主要包括：（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析：利用Scanpy处理来自PRJCA007744队列（100例HCC样本，79例患者）的scRNA-seq数据，经质量控制、批次效应校正（BBKNN）和Leiden聚类，构建包含871,457个高质量细胞、13种主要细胞类型的细胞参考图谱；（2）空间转录组学分析：对HRA000437队列（12个Visium组织切片，来自5例患者）的空间转录组数据进行处理，使用STAligner进行空间对齐和整合，并通过cell2location进行空间解卷积，结合Leiden聚类和层次聚类识别共识空间生态位；（3）空间蛋白组学验证：使用51-plex Akoya PhenoCycler平台（包含48个视野）对独立空间多组学队列进行蛋白水平正交验证；（4）机器学习模型构建：在EGAS00001005503队列（304例ATZ/BVZ治疗患者，70%训练/30%内部验证）中评估九种机器学习算法，最终选择XGBoost模型，结合SHAP分析进行特征解释和基因签名构建；（5）独立外部验证：使用GSE202069和GSE285963（87例预处理ATZ/BVZ样本）队列验证特征签名的预测效能。
此外，研究还采用了多种计算分析工具，包括MISTy框架评估空间共定位、stLearn分析配体-受体互作、pySCENIC分析转录因子调节子活性、scFEA推断空间代谢通量、GSVA评分评估通路活性等。独立空间验证队列为基于纳武利尤单抗（nivolumab）的围手术期队列，包含13例患者（6例响应者，7例非响应者）。
**四、研究结果**
**4.1 单细胞图谱描绘HCC的细胞景观**
研究人员整合了PRJCA007744队列的100例HCC scRNA-seq样本，质控后保留871,457个高质量细胞。通过BBKNN有效校正批次效应后，基于经典标志基因鉴定出13种主要细胞类型，涵盖免疫、基质、内皮和恶性 compartments。观测/期望比（Ro/e）富集分析揭示了分期相关的微环境差异：早期肿瘤富集naive T细胞、浆细胞和肝窦内皮细胞（LSECs），而晚期肿瘤显示出增加的基质和免疫抑制性群体，包括e2fCAFs、SPP1阳性肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和iCAFs。
**4.2 空间转录组学鉴定出与免疫治疗获益相关的免疫富集生态位**
研究人员整合了12个空间转录组切片（48,416个点，33,538个基因）。基于cell2location的解卷积和聚类分析鉴定出21个初始空间聚类，经层次聚类合并为九个共识空间生态位（Niche 1–9）。其中Niche 9表现出最强的免疫富集表型，富集B细胞、浆细胞、自然杀伤（NK）细胞、naive T细胞、调节性T细胞和IL4I1阳性巨噬细胞，并在多个切片中检测到，分布于瘤周和瘤内区域。基于Niche 9上调基因构建的转录程序在独立bulk免疫治疗队列中评估显示，高程序评分与更高的ATZ/BVZ响应率及延长的总生存期（overall survival，OS）和无进展生存期（progression-free survival，PFS）相关。
**4.3 独立空间验证重现Niche 9相关状态**
将发现队列中Niche 9前100个上调基因投射到独立响应注释HCC队列的预处理Visium样本。AUCell分析显示Niche 9活性呈异质性空间分布，前10%评分点定义为Niche 9高区域。在池化点水平，响应者中Niche 9高区域更频繁（594/4013，14.80% vs 530/7227，7.33%；OR=2.20，p=4.06×10?3?）。空间共配准的CODEX分析支持淋巴富集表型：Niche 9连续活性与CD4 T细胞、B细胞、CD8 T细胞、树突状细胞和IFNγ阳性细胞呈正相关，与内皮和上皮群体呈负相关。
**4.4 免疫富集生态位的功能和代谢特征**
Niche 9显示出最强的适应性免疫和组织化淋巴程序富集，包括B细胞受体、趋化因子、淋巴细胞共刺激和白细胞粘附通路。空间映射证实了Niche 9内B细胞受体信号和淋巴细胞共刺激的局部富集。空间代谢推断进一步鉴定了Niche 9中与其他生态位不同的氨基酸、脂质、谷胱甘肽、蛋氨酸及相关代谢程序。
**4.5 空间共定位和配体-受体相关基因共表达模式**
MistyR分析揭示了Niche 9内淋巴、髓系、浆细胞和肿瘤群体间的共定位关系。点水平共表达分析识别出重复出现的空间富集模式，包括SLAMF7-SLAMF7、CD84-CD84、CADM1-CADM1和MMP9-CD44。SLAMF7-SLAMF7富集区域的共享上调基因富集于免疫球蛋白相关组件。
**4.6 MEI1阳性浆细胞显示独特的分泌转录状态**
MEI1在浆细胞中优先表达，MEI1阳性细胞富集内质网加工、蛋白输出、N-糖基化、免疫球蛋白相关和B细胞受体程序。调节子分析鉴定出SREBF2、ETV6、CREB3L2和NFKB1活性增加，其预测靶标涉及炎症信号、脂质代谢、应激适应和细胞周期调节。
**4.7 免疫富集生态位相关程序与免疫治疗响应的关联**
在EGAS00001005503队列中评估基于Niche 9前100个上调基因的程序，XGBoost模型表现最佳，训练和验证AUC分别为0.945和0.734，最终模型在训练、内部测试和独立验证队列中ROC-AUC分别为0.955、0.712和0.708。特征重要性和SHAP分析突出免疫相关基因，包括CD19、CD8B、CXCL13、SLAMF7、MEI1、ICOS、FCRL5、BLK、FCRL2和TNFRSF13C。
**4.8 生态位相关程序与免疫特征和临床结局的关联**
十基因特征高分与适应性免疫通路富集相关。MCP-counter分析显示程序高肿瘤中T细胞、细胞毒性、B谱系、NK细胞、单核细胞和髓系树突状细胞特征增加，B谱系关联最强。Spearman相关分析显示十基因GSVA评分与B谱系细胞（ρ=0.90）、T细胞（ρ=0.87）、细胞毒性淋巴细胞（ρ=0.79）、CD8+ T细胞（ρ=0.78）、髓系树突状细胞（ρ=0.66）和ESTIMATE ImmuneScore（ρ=0.83）强正相关。临床上，高程序评分与更高的免疫治疗响应率、更低的TIDE评分及改善的OS和PFS相关。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，Niche 9是一种可重复的空间免疫状态，具有TLS相关的分子和细胞特征，包括B细胞和浆细胞富集、B细胞受体信号、淋巴细胞共刺激、趋化因子信号及TLS相关转录程序。Niche 9出现在瘤内和瘤周区域，常位于肿瘤-基质界面附近，提示局部细胞组织可能有助于抗原呈递、淋巴细胞募集和免疫活性维持。研究强调，Niche 9不应被视为直接建立的ATZ/BVZ响应空间生物标志物，但其转录程序在独立预处理nivolumab为基础的空间队列响应者中富集，并在独立ATZ/BVZ治疗bulk队列中显示一致的响应和生存关联。
研究同时承认若干局限性：发现队列缺乏匹配ATZ/BVZ结局，外部空间队列接受nivolumab为基础的治疗，空间响应分析在池化点水平进行，空间队列规模有限，CODEX衍生的区域蛋白富集可能反映细胞组成差异等。代谢状态、配体-受体关系、转录程序和MEI1阳性浆细胞的生物学作用均为计算推断，需要实验验证。
研究结论部分总结：研究人员在肝细胞癌中鉴定出一个可重复的淋巴富集空间免疫生态位，具有三级淋巴结构相关的分子和细胞特征。该生态位的特征是协调的淋巴和髓系组织、独特的代谢和细胞间通讯程序，以及具有增强分泌适应的MEI1阳性浆细胞状态。Niche 9衍生的转录特征在独立bulk队列中与阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗的响应和良好临床结局相关。这些发现支持空间免疫组织与HCC免疫治疗敏感性之间的关联，并为将空间定义的免疫状态转化为临床适用的转录组生物标志物提供了分子框架。进一步的匹配治疗空间和功能验证将需要建立其预测和机制相关性。
