《Cell Reports》：Cryo-EM and biochemical characterization of a BRAF/CRAF heterodimer shows that the NtA motif negative charge is dispensable for RAF activation
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在RAS驱动的膜招募后，RAF激酶ARAF、BRAF和CRAF通过同二聚化或异二聚化被激活，以启动MAP激酶信号传导。尽管RAF异二聚体驱动生理性和致癌性信号，它们在结构和生化水平上仍很少被研究。在此，研究人员报告了14-3-3结合的BRAF/CRAF异二聚体
在RAS驱动的膜招募后，RAF激酶ARAF、BRAF和CRAF通过同二聚化或异二聚化被激活，以启动MAP激酶信号传导。尽管RAF异二聚体驱动生理性和致癌性信号，它们在结构和生化水平上仍很少被研究。在此，研究人员报告了14-3-3结合的BRAF/CRAF异二聚体复合物的制备、生化表征和冷冻电镜（cryo-EM）结构。该异二聚体表现出介于BRAF和CRAF同二聚体之间的或与之密切匹配的动力学参数和RAF抑制剂敏感性。冷冻电镜结构揭示了与RAF同二聚体相同的组织，并且在MEK1结合结构中存在一种独特的不对称相互作用，其中BRAF的酸性NtA基序与CRAF的RKTR基序相结合。突变分析显示，将酸性NtA序列替换为碱性RARA可产生活性二聚体，表明负电荷对于活性是非必需的。总的来说，研究人员的发现表明NtA电荷状态通过影响局部骨架动力学和失活态稳定性来影响RAF活性，而不是通过跨二聚体界面的立体特异性识别。
RAF家族激酶（ARAF、BRAF、CRAF）是RAS/MAP激酶（MAPK）信号通路的关键节点。在RAS驱动下，RAF被招募至细胞膜并发生同二聚化或异二聚化，进而磷酸化下游MEK1/2。尽管RAF异二聚体在生理性和致癌性信号中发挥重要作用，但此前对其结构和生化特性的研究十分有限。现有结构研究多集中于自抑制态RAF或三种亚型的活性同二聚体，RAF异二聚体缺乏高分辨率结构信息。此外，RAF亚型间存在一个被称为N端酸性基序（NtA，即N-terminal acidic motif，RAF激酶N端一段富含酸性残基的序列）的差异区域：ARAF和CRAF的NtA含有可磷酸化的酪氨酸和丝氨酸（SGYY/SSYY），BRAF则为SSDD序列，且两个丝氨酸被组成性磷酸化。以往研究表明该区域负电荷（通过磷酸化或酸性突变）对RAF激活至关重要，但NtA片段在已知结构中不可见，其作用机制一直不清楚。因此，研究人员开展了BRAF/CRAF异二聚体的制备、生化表征和结构分析，以阐明其激活机制及NtA基序的功能。
研究人员利用杆状病毒/Sf9昆虫细胞表达系统共表达人BRAF（残基435-766，N端Strep标签）和CRAF（残基308-648，含Y340D/Y341D激活替换，N端His6标签），通过顺序亲和层析（HisTrap和StrepTrap）及尺寸排阻色谱纯化获得14-3-3结合的BRAF/CRAF异二聚体复合物。为获得不对称冷冻电镜复合物，研究人员在CRAF中引入F559E/R563A突变（CRAFFERA）以破坏其与MEK1的结合，并与MEK1 S218A/S222A突变体共表达。酶活实验采用基于时间分辨荧光共振能量转移的激酶实验（TR-FRET），并以此测定动力学参数和12种RAF抑制剂的IC50。冷冻电镜数据在Titan Krios上收集，经CryoSPARC和RELION进行单颗粒重构，模型用COOT和Phenix精修；分子动力学（MD）模拟采用AMBER/OpenMM进行。研究未使用患者样本，所有蛋白均来自重组昆虫细胞表达。
研究结果如下：
1. Preparation, characterization, and inhibitor sensitivity of BRAF/CRAF heterodimers
通过上述纯化方法得到BRAF/CRAF/14-3-3异二聚体复合物。TR-FRET实验显示，该异二聚体的活性略高于BRAF或CRAF同二聚体。ATP滴定得到米氏常数Km[ATP]=2.3 μM，MEK1滴定得到Km[MEK]=133 nM，与同二聚体测量值（BRAF ATP Km 1.9 μM，CRAF ATP Km 0.7 μM；MEK1 Km 30–150 nM）一致；高ATP浓度下存在底物抑制，表观Ki约3 mM。对12种结构多样的RAF抑制剂进行滴定，异二聚体的IC50值通常介于两种同二聚体之间或与之接近；其中II型抑制剂对异二聚体的抑制效力更接近BRAF同二聚体。这表明异二聚体在催化特征和抑制剂反应方面与同二聚体高度相似。
2. Cryo-EM structures of BRAF/CRAF heterodimers
冷冻电镜分别解析了BRAF/CRAF/14-3-3复合物（3.3 ?）和BRAF/CRAF/MEK1/14-3-3复合物（3.9 ?）的结构。两种结构中BRAF和CRAF激酶结构域形成典型的侧向并列活性二聚体，C端尾部由14-3-3二聚体结合，整体组织与BRAF同二聚体结构（PDB: 6UAN）高度相似（RMSD 1.65 ?）。在MEK1结合结构中，MEK1与BRAF原聚体面对面结合，并观察到BRAF的NtA基序（SSDD）跨过二聚体界面与CRAF的RKTR基序（Arg398/Lys399）形成氢键和盐桥。分子动力学模拟显示，Asp448与Arg398之间的接触在1 μs模拟中持续存在，但NtA骨架整体柔性较大，其他相互作用并不恒定。因此，NtA-RKTR接触在结构上可见，但具有动态性。
3. Negative charge is not required in the NtA motif of BRAF or CRAF
突变分析表明，将BRAF或CRAF的酸性NtA序列SSDD替换为碱性RARA后，BRAFRARA和CRAFRARA同二聚体以及BRAF/CRAF异二聚体均保持高活性，甚至高于SSDD版本；而将RKTR基序中的RK替换为EE（BRAFEE或CRAFEE）则基本消除活性；BRAF的AAAA替换也导致无活性。特别地，BRAFEE与激酶失活的CRAFKD/RARA共表达可恢复活性，而与CRAFKD/SSDD共表达则不能。这些结果明确证明，NtA基序的负电荷对于RAF激活并非必需，跨界面的立体特异性识别也不是活性所必需。
在讨论部分，研究人员将上述结果与此前自抑制CRAF结构比较，提出NtA片段与一个保守色氨酸残基（BRAF Trp450，CRAF Trp342）相邻，该色氨酸参与稳定失活的αC-helix-out构象。NtA的电荷状态（无论酸性还是碱性）可能通过改变局部骨架动力学，影响该色氨酸锚定的失活构象的稳定性，从而调节RAF向活性构象转变的能垒。因此，NtA对RAF活性的调控更可能是一种电荷依赖的构象动态效应，而非作为固定的跨界面识别基序。研究也存在一些限制，如MEK1区域的冷冻电镜密度较弱、可能存在不含MEK1的颗粒，以及RARA替换结果仍需在细胞环境中验证。
结论：14-3-3结合的BRAF/CRAF异二聚体在动力学参数和抑制剂敏感性方面与BRAF和CRAF同二聚体高度相似；BRAF的NtA基序可与CRAF的RKTR基序发生不对称的跨界面接触，但这种接触并非RAF激活所必需。NtA基序的负电荷状态不是RAF活性的要求，其作用是通过影响局部骨架动力学和失活态稳定性来实现的。
