水飞蓟素竞争性抑制人有机阴离子转运体1和3并减少替诺福韦蓄积及细胞毒性

《Journal of Xenobiotics》：Assessment of the Drug Interaction Potential of Silymarin Through Inhibition of Human Organic Anion Transporters 1 and 3

　　

背景：水飞蓟素（silymarin）被广泛用作肝保护和肾保护剂。然而，其与肾脏有机阴离子转运体（organic anion transporters, OATs）发生相互作用的潜力仍知之甚少。本研究考察水飞蓟素及其主要成分水飞蓟宾（silybin）对人（human, h）OAT1和hOAT3转运功能以及转运体介导的药物蓄积的影响。方法：使用稳定表达hOAT1或hOAT3的Madin–Darby犬肾（Madin–Darby canine kidney, MDCK）细胞研究水飞蓟素与hOAT1和hOAT3的相互作用及机制。结果：水飞蓟素以浓度依赖方式显著抑制hOAT1和hOAT3介导的转运，半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）分别为0.32和0.65 μg/mL。水飞蓟宾也抑制两种转运体，但效力较低，对hOAT1和hOAT3的IC₅₀分别为3.02 μg/mL和8.5 μg/mL。动力学研究显示米氏常数（Michaelis constant, K_t）值增加而最大转运速率（maximum transport rate, J_max）无变化，提示竞争性抑制（competitive inhibition）。分子对接（molecular docking）显示多种水飞蓟素成分对两种转运体底物结合口袋具有较强结合亲和力，支持竞争性相互作用机制。功能上，水飞蓟素显著降低OAT底物药物替诺福韦（tenofovir）的蓄积。一致地，水飞蓟素减轻表达hOAT1和hOAT3细胞中替诺福韦诱导的细胞毒性，且在hOAT1细胞中观察到更强的保护作用。结论：这些发现表明水飞蓟素抑制hOAT1和hOAT3，并突出两种转运体介导的水飞蓟素–药物相互作用的潜力。

水飞蓟素（silymarin）作为保肝、保肾的互补药物被广泛使用，但其与肾脏有机阴离子转运体（human organic anion transporters, hOATs）的相互作用尚不清楚。人OAT1和hOAT3主要表达于肾近端小管上皮细胞基底侧膜，广泛转运内源性有机阴离子及β-内酰胺类抗生素、抗病毒药、利尿剂、甲氨蝶呤、非甾体抗炎药和抗癌药等阴离子药物，参与肾小管分泌、细胞内药物蓄积和肾毒性。既有资料提示水飞蓟素及水飞蓟宾（silybin）可与P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、乳腺癌耐药蛋白和有机阴离子转运多肽等转运体相互作用，且水飞蓟宾曾被报道抑制OAT1和OAT3；但水飞蓟素提取物与肾脏OAT1和OAT3的作用、机制及功能后果仍缺乏系统认识。因此，研究人员以稳定表达hOAT1或hOAT3的Madin–Darby犬肾（Madin–Darby canine kidney, MDCK）细胞为模型，评价水飞蓟素和水飞蓟宾对转运功能、动力学、分子对接、替诺福韦（tenofovir）蓄积及细胞毒性的影响。研究结论为水飞蓟素以浓度依赖方式抑制hOAT1和hOAT3，机制符合竞争性抑制，并可减少替诺福韦蓄积、减轻替诺福韦诱导的细胞毒性，提示其具有转运体介导的水飞蓟素–药物相互作用潜力；其意义在于补充肾脏OAT介导草药–药物相互作用的体外证据。
研究方法概括：研究人员采用稳定表达hOAT1或hOAT3的MDCK细胞及mock细胞，以³H-PAH和³H-estrone sulfate进行摄取抑制实验并计算IC₅₀；用非放射性底物进行动力学分析；以hOAT1实验结构（PDB 9MC8）和hOAT3同源模型进行分子对接；用MTT法检测细胞活力；用超高效液相色谱–四极杆飞行时间串联质谱（UHPLC–QTOF-MS/MS）测定替诺福韦胞内蓄积。该研究未涉及临床样本队列。
结果部分如下：
3.1 水飞蓟素对hOAT1和hOAT3转运功能的抑制作用。通过MDCK-hOAT1、MDCK-hOAT3和mock细胞的底物摄取实验发现，5 μg/mL水飞蓟素显著降低hOAT1介导的³H-PAH蓄积和hOAT3介导的³H-estrone sulfate蓄积；5–100 μg/mL处理4 h未改变细胞活力，提示所观察到的抑制并非细胞毒性所致。浓度–反应实验显示抑制呈浓度依赖，水飞蓟素对hOAT1和hOAT3的IC₅₀分别为0.32±0.1和0.65±0.3 μg/mL；水飞蓟宾也浓度依赖抑制两种转运体，IC₅₀分别为3.02±1.0 μg/mL（hOAT1）和8.5±1.3 μg/mL（hOAT3），效力低于水飞蓟素提取物。
3.2 水飞蓟素和水飞蓟宾对hOAT1和hOAT3的抑制机制。在1 μg/mL水飞蓟素或10 μg/mL水飞蓟宾存在下，动力学分析显示hOAT1和hOAT3的K_t显著升高而J_max不变，结果符合竞争性抑制，即干扰底物结合而非改变转运体表达或固有转运能力。
3.3 水飞蓟素生物活性成分与hOAT1和hOAT3的分子对接。研究人员以hOAT1结构（PDB 9MC8）和基于9MC8构建的hOAT3同源模型，对silybin A、silybin B、silychristin、silydianin、isosilybin A和isosilybin B进行对接。所有成分均可进入两种转运体的底物结合口袋，并与周围残基形成多重相互作用；hOAT1中多种成分的对接分数较参考底物PAH更负，hOAT3中预测结合能与底物estrone sulfate相当。hOAT1再对接验证可重现PAH实验结合姿态（RMSD 1.87 ?），而hOAT3无实验配体结合结构。作者强调对接结果仅提供与竞争性机制一致的结构假设，不能替代直接结合实验。
3.4 水飞蓟素对过表达hOAT1和hOAT3的MDCK细胞中阴离子药物蓄积的影响。用500 μM替诺福韦孵育4 h后，仅MDCK-hOAT1细胞检测到明显胞内替诺福韦蓄积，MDCK-hOAT3和mock细胞低于检测限，提示该体系中hOAT1是替诺福韦摄取的主要转运体。1 mM PAH显著降低MDCK-hOAT1细胞的替诺福韦蓄积；水飞蓟素5 μg/mL显著降低蓄积，50 μg/mL作用更强。细胞毒性实验中，250 μM替诺福韦不改变mock细胞活力，但显著降低MDCK-hOAT1和MDCK-hOAT3细胞活力，hOAT1细胞下降更明显；水飞蓟素5和50 μg/mL均减轻hOAT1细胞中替诺福韦诱导的细胞毒性，而hOAT3细胞仅在50 μg/mL时观察到保护作用。原文同时指出，不能排除水飞蓟素自身细胞保护作用对替诺福韦毒性减轻的部分贡献。
讨论部分总结：研究人员指出，本研究首次证明水飞蓟素以浓度依赖方式强效抑制hOAT1和hOAT3，且hOAT1对水飞蓟素抑制更敏感；水飞蓟宾的抑制弱于水飞蓟素提取物，结合对接结果提示多种黄酮木脂素成分可能共同贡献总体抑制活性。动力学表现为K_t升高、J_max不变，支持竞争性抑制。鉴于hOAT1和hOAT3是多种内源性物质和临床药物肾脏摄取及小管分泌的关键决定因素，水飞蓟素可能改变OAT底物药物的肾脏处置和药代动力学，并对替诺福韦等依赖OAT摄取产生肾毒性的药物具有潜在影响；功能实验支持水飞蓟素减少替诺福韦蓄积并减轻其细胞毒性。讨论也指出局限性：分子对接只能生成结合模式假设，不能测定亲和力或证明竞争性抑制，Vina评分为经验近似，未充分纳入蛋白柔性、溶剂化和熵效应，且对接基于单一静态构象；尚缺乏体内药代动力学数据及肾脏未结合浓度资料；水飞蓟素口服生物利用度较低、代谢广泛并与血浆蛋白结合，使体内相关性仍不确定；水飞蓟素自身细胞保护作用亦可能部分解释毒性减轻。
研究结论部分翻译：现有发现表明，受试水飞蓟素制剂在体外抑制hOAT1/hOAT3介导的转运，多种黄酮木脂素成分可能参与所观察到的活性。这些观察拓展了对水飞蓟素药理作用的认识，并突出其参与转运体介导的草药–药物相互作用的潜力。