氧分层三维结肠仿生共培养平台 Mm 3D-HaeMan 揭示 SCFA 交叉喂养驱动的宿主–微生物动态及上皮–免疫响应

《Gut Microbes》：A stratified human colon model reveals SCFA cross-feeding-driven host–microbe dynamics associated with epithelial and immune responses

　　

宿主–微生物互作对维持肠道稳态至关重要，但多数体外模型缺乏生理性氧梯度、黏膜结构及可重复性。研究人员开发了黏膜仿生三维宿主需氧微生物群厌氧共培养（Mucosal Mimetic 3D–Host Aerobic Microbiota Anaerobic Co-culture，Mm 3D-HaeMan）系统，这是一种结肠仿生、氧分层平台，可实现结肠上皮细胞、人外周血单个核细胞（human peripheral blood mononuclear cells，hPBMCs）与专性厌氧菌的稳定共培养。氧分布分析证实了与人类结肠分层一致的稳定梯度。研究人员利用经典短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）交叉喂养配对（Anaerostipes caccae 与 Bifidobacterium bifidum，AcBb 联合体），对宿主–微生物界面开展了整合、多层分析。与产 SCFA 的 AcBb 联合体共培养与上皮线粒体呼吸增强、跨上皮电阻维持、紧密连接蛋白表达且无屏障破坏以及细胞因子谱重平衡相关。宿主转录组学鉴定出 41 个差异表达基因（15 个上调、26 个下调），这些基因与稳态相关上皮反应有关。同时，细菌宏转录组学揭示 29 个差异表达基因家族；值得注意的是，glaK 在纯细菌培养中富集；SORD、nuoG 和 nuoE 在共培养期间被特异性诱导，表明存在宿主相关的细菌转录变化。区室化设计允许独立采样，以进行层分辨多组学和功能读数。这些发现确立了 Mm 3D-HaeMan 作为具有生理学基础的平台，可用于解析双向宿主–微生物反应和免疫相关互作。该模型在机制研究以及益生菌和基于微生物组的治疗转化筛选中具有广泛适用性。

宿主–微生物互作是维持肠道稳态的核心环节，但现有研究体系仍存在明显瓶颈：动物模型在肠道生理、微生物组和膳食代谢方面与人存在种间差异；传统静态体外模型和肠道类器官难以复现机械力、微生物复杂性及三维黏膜结构；氧作为结肠主要生态约束，若不能重现黏膜氧分层，则难以稳定共培养严格厌氧菌并解析代谢物驱动的宿主读数。已有 Transwell 共培养、HoxBan、gut-on-a-chip、HuMiX、微需氧垂直扩散室等平台虽各有方法学进展，但部分依赖微流控或专用厌氧设备，在通量、多组学生物量及可及性方面受限；多数平台使用癌源上皮细胞系，未将循环免疫成分与严格厌氧菌同时纳入，也未同时开展宿主与微生物的层分辨转录组分析。基于此，研究人员开发 Mm 3D-HaeMan，并发表于《Gut Microbes》。该研究构建三层垂直排列、分子连续的结肠仿生平台：液体层支持需氧宿主细胞，中间黏液仿生层允许分子扩散，半固体 Gelrite 层支持严格厌氧菌；将非致瘤人结肠上皮细胞 CCD841CoN 与 hPBMCs 置于插入膜两面，将 AcBb 联合体接种于半固体层，共培养 18 h。氧分布显示上皮/免疫层为 9.5–3.2% O₂，黏液层为 3.2–1.7%，细菌层为 1.7–0.2%，支持好氧宿主细胞与严格厌氧菌共存。研究得出，AcBb 共培养与上皮线粒体呼吸增强、跨上皮电阻维持、紧密连接蛋白表达无明显破坏及细胞因子谱重塑相关；宿主转录组鉴定 41 个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），细菌宏转录组鉴定 29 个差异表达基因家族，并观察到宿主细胞类型相关的细菌转录变化。该平台的意义在于以标准细胞培养基础设施实现稳定厌氧共培养和层分辨多组学采样，降低技术门槛，为机制研究和益生菌、微生物组治疗转化筛选提供可控、可及的分析框架。
关键方法概括：研究采用三层插入式共培养构建氧分层宿主–微生物界面；以氧微电极测量分层溶解氧；以物种特异性定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）定量细菌载量；以超高效液相色谱–串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）定量 SCFA；以 Seahorse XFp 线粒体压力测试测定耗氧率（oxygen consumption rate，OCR）和细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR）；以跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）、跨上皮电压（transepithelial voltage，Vte）、免疫荧光和 Western blot 评估屏障与连接蛋白；以多重细胞因子阵列和细胞术微珠阵列（cytometric bead array，CBA）分析细胞因子；以宿主 RNA 测序和细菌宏转录组测序进行层分辨转录组分析。样本来源方面，CCD841CoN 与 hPBMCs 购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），A. caccae KCTC 15019、B. bifidum YF217 等为研究中使用的代表性菌株。
研究结果方面：第一，“具生理氧分层的结肠仿生共培养平台构建”：通过分层组装及 0 和 18 h 氧微电极测量，建立液体层、黏液层和半固体细菌层，观察到稳定氧梯度，支持需氧宿主细胞与严格厌氧菌在同一平台共存。第二，“Mm 3D-HaeMan 中 SCFA 交叉喂养菌与宿主细胞共培养条件优化”：通过 OD₆₀₀、物种特异性 qPCR、SCFA 定量及宿主细胞活力/密度比较不同培养基和接种条件，确定 TSB 较 MRS 更支持联合体生长和 SCFA 产出，AcBb 共培养较单培养显著增加丁酸积累；在优化条件下 CCD841CoN 与 hPBMCs 活力及密度未见显著差异，并确定 AcBb-L 为后续主条件。第三，“SCFA 交叉喂养菌对宿主细胞的特异性转录响应”：通过四种 AcBb 培养条件的宏转录组分析及 qPCR 确认细菌丰度无显著差异，鉴定 29 个差异表达基因家族；glaK 在纯菌培养中富集，SORD、nuoG 和 nuoE 在共培养中诱导；AcBb 接种后检测到乙酸、丁酸、丙酸和琥珀酸，而宿主细胞类型未显著改变总体 SCFA 输出，提示宿主相关的细菌转录调节。第四，“AcBb 来源 SCFA 产生共培养条件调节上皮线粒体功能和免疫调节细胞因子重塑”：通过 Seahorse 检测发现 AcBb 共培养提高 CCD841CoN 的 OCR 和 ECAR，包括基础呼吸、质子漏和最大呼吸能力；MTT 显示活 AcBb 的效应最大，热杀死菌和培养上清未复现；TEER 维持、Vte 在 AcBb 组更负、ZO-1 顶端连接定位及 JAM-A/claudin-1 表达未见明显破坏；细胞因子阵列显示 TSP-1 和 TIM-3 上调、多种炎症/趋化/血管生成相关介质下调，CBA 显示 TNF-α、IL-8 和 IL-10 升高而 IL-6 不变，提示背景依赖性细胞因子重塑。第五，“Mm 3D-HaeMan 中宿主上皮转录组对 SCFA 交叉喂养菌的重塑”：通过宿主 RNA 测序、主成分分析、差异表达和基因本体富集，发现 AcBb 未引起全局转录组强偏移，但鉴定 41 个 DEGs（15 上调、26 下调）；上调包括 HILPDA、MUC20、MECOM 等，下调包括 SLC2A5、CP、HDAC9、TNFSF9 等；富集分析显示肌动蛋白丝组织和细胞器组织等过程上调，RNA 聚合酶 II 转录负调控、染色质组织和核酸代谢等过程负富集，提示适度转录响应，与线粒体和细胞因子读数方向一致，但原文强调需正交验证。
讨论部分总结：该平台复现结肠相关氧梯度，采用非致瘤 CCD841CoN 和 hPBMCs 分别作为上皮与循环免疫替代，并以 AcBb 建立 SCFA 交叉喂养代谢环境；整合 OCR/ECAR、TEER/Vte、连接蛋白、免疫Profiling、宿主转录组和细菌宏转录组，支持在单一实验框架内开展多层分析。局限包括：CCD841CoN 并非高阻、完全极化的肠上皮屏障，hPBMCs 非肠黏膜驻留免疫群体，Gelrite 固定限制直接接触依赖过程，SCFA 单独因果尚未确立，细胞因子阵列与 CBA 为互补半定量/定量平台，且群落简化。应用上可用于机制研究、患者来源个性化建模及微生物组治疗筛选。研究结论翻译：总之，这些发现表明，在产 SCFA 条件下 AcBb 共培养与上皮代谢活性、连接蛋白表达、细胞因子谱及宿主细胞背景依赖性细菌转录反应的变化相关；因此，Mm 3D-HaeMan 系统是一个受控且分析可及的平台，可在确定的氧梯度下解析黏膜界面的双向宿主–微生物动态。