淡水沉积物来源两株Ferruginibacter新种的多相分类及SUN106T中推定class I lanthipeptide生物合成基因簇的基因组解析

《Microorganisms》：Two Novel Ferruginibacter Species from Freshwater Sediments and a Putative Class I Lanthipeptide Biosynthetic Gene Cluster of SUN106T

　　

淡水沉积物蕴藏分类学多样且生物合成潜力尚未充分探索的细菌。本研究中，研究人员采用多相分类学（polyphasic taxonomy）方法对分离自韩国淡水沉积物的两株橙色色素菌株SUN002^T和SUN106^T进行了表征。系统发育、表型、化学分类学及基于基因组的分析支持将其归类为Ferruginibacter属内两个新种，分别提议命名为Ferruginibacter aquae sp. nov.和Ferruginibacter aurantiacus sp. nov.。与已建立的Ferruginibacter物种相比，获得的最高平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）和数字DNA–DNA杂交（digital DNA–DNA hybridization, dDDH）值分别为87.3%和33.7%，均低于公认的物种界定阈值。基因组挖掘在SUN106^T中鉴定出一个推定I类羊毛硫肽（class I lanthipeptide）生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC），包含lanB、lanC和lanT，并伴有8个相邻的候选LanA样前体开放阅读框（open reading frame, ORF）。预测的核心区富含Ser、Thr和Cys残基，并经计算预测可支持多个硫醚交联。SUN106^T粗提物对Bacillus subtilis表现出抑制活性；然而，对培养上清、细胞结合和裂解物组分进行的靶向UPLC–QTOF–MS分析未检测到令人信服的预测成熟产物或前体相关产物证据。目前尚不能将观察到的抗菌活性归因于该推定BGC。总之，这些发现扩展了Ferruginibacter属已认知的分类学和生物合成多样性，并为未来对淡水细菌中隐秘I类羊毛硫肽生物合成的功能表征提供了基因组基础。

研究背景方面，淡水沉积物细菌分类学多样且生物合成潜力尚未充分探索；羊毛硫肽（lanthipeptides）是核糖体合成和翻译后修饰肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, RiPPs）的重要类群，具有抗菌、抗病毒、抗癌和镇痛等多种活性，其生物合成由含前体肽基因和修饰酶基因的生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）编码。I类系统使用独立的LanB脱水酶和LanC环化酶，II–IV类使用多功能修饰酶，V类采用激酶/裂解酶脱水机制。Bacteroidetes中虽有基因组挖掘预测的羊毛硫肽BGC多样性，但实验表征产物仍有限。Ferruginibacter由Lim et al.于2009年首次描述自淡水沉积物，后续物种增加，但基因组尺度多样性和BGC库比较信息有限；近缘菌株16S rRNA基因序列相似性高可复杂化物种界定，需以平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）和数字DNA–DNA杂交（digital DNA–DNA hybridization, dDDH）补充系统发育、表型与化学分类学证据。研究人员因此对分离自韩国淡水沉积物的SUN002^T和SUN106^T开展多相分类学（polyphasic taxonomy）和比较基因组分析，并重点解析SUN106^T中推定I类羊毛硫肽BGC，辅以初步抗菌试验和靶向UPLC–QTOF–MS筛选。结论支持两株菌分别为Ferruginibacter aquae sp. nov.和Ferruginibacter aurantiacus sp. nov.，并揭示SUN106^T含一个具8个候选前体ORF的推定I类羊毛硫肽BGC；其预测产物在测试条件下未获化学验证。该研究扩展了Ferruginibacter的分类学和生物合成多样性，并为淡水细菌中前体多样化与成熟研究提供明确的基因组位点。

关键技术方法（≤250字）：研究人员于2021年6月从韩国Yonghak River和Ssangcheon采集淡水沉积物并分离SUN002^T与SUN106^T；采用16S rRNA基因系统发育分析、表型/生理测试、API试验、脂肪酸和极性脂分析进行多相分类；用Illumina HiSeq 2500测序，经SPAdes组装、Prokka/RAST/eggNOG/InterProScan注释；以IPGA计算ANI、GGDC计算dDDH，antiSMASH预测BGC，anvi’o进行泛基因组分析；用BLASTP、RiPPMiner、ClustalW/Jalview/MEGA分析候选LanA样前体；以琼脂孔扩散法检测粗提物抗菌活性，并以靶向UPLC–QTOF–MS筛选培养上清、细胞结合和裂解物组分。

研究结果如下。3.1 系统发育、生理与化学分类学特征：SUN002^T的近完整16S rRNA基因序列与F. albus KIS38-8^T相似性97.31%，SUN106^T与F. profundus DS48-5-3^T相似性99.71%；邻接法、最大似然法和最大简约法均将两株菌置于Ferruginibacter属内。两株菌为革兰阴性、非运动、好氧、杆状，28 °C培养2天后形成橙色菌落；SUN002^T细胞宽0.5–0.7 μm、长1.2–1.7 μm，SUN106^T约宽0.7 μm、长2.3 μm，均未见鞭毛；二者在Bennett、R2A和营养琼脂上生长，不在LB、ISP4、PDA或海洋琼脂上生长，SUN002^T额外在ISP2琼脂上生长；二者15–30 °C生长、最适25 °C，SUN002^T在pH 5.0–8.0和0–1% NaCl生长，SUN106^T在pH 6.0–9.0生长但不耐NaCl。API ZYM显示二者α-胰凝乳蛋白酶和α-半乳糖苷酶阳性，SUN002^T另β-葡萄糖苷酶阳性，SUN106^T另β-葡萄糖醛酸酶和α-甘露糖苷酶阳性；主要脂肪酸为iso-C15:1 G、iso-C15:0和iso-C17:0 3-OH，二者iso-C17:0 3-OH比例高于各自参考菌；极性脂含磷脂酰乙醇胺和未鉴定糖脂。3.2 基因组特性与比较基因组分析：SUN002^T基因组3.2 Mb、5个contig、N50 2.7 Mb、G+C 36.5%，含2766个预测基因（2726个蛋白编码序列、40个RNA基因）；SUN106^T基因组5.8 Mb、10个contig、N50 1.1 Mb、G+C 38.0%，含4958个预测基因（4898个蛋白编码序列、60个RNA基因）。七株Ferruginibacter基因组比较鉴定1165个核心、3233个共享和8029个单例基因簇；基因组大小3.2–6.9 Mb；antiSMASH预测所有七株均含萜烯BGC，SUN002^T另含聚酮合酶BGC，SUN106^T含萜烯前体、hserlactone和羊毛硫肽BGC，F. profundus DS48-5-3^T也预测到相关推定I类羊毛硫肽BGC。SUN002^T与所检查Ferruginibacter模式菌的ANI为68.8%–75.6%、dDDH为18.5%–20.8%；SUN106^T的ANI为68.8%–87.3%、dDDH为18.3%–33.7%，均支持二者与所检查模式菌的基因组区分，并据此提出两个新种。3.3 SUN106^T推定I类羊毛硫肽BGC的基因组结构与预测生物合成特征：antiSMASH鉴定的区域含lanB（预测脱水酶）、lanC（预测环化酶）和lanT（ATP结合盒转运蛋白），并伴8个相邻候选LanA样ORF（ctg5_99–ctg5_106）；基因组共定位、链方向、序列特征、RiPPMiner预测和BLASTP比较支持其为候选前体肽基因。候选肽长62–73个氨基酸，N端前导区较保守、C端核心区较多变；SKLQLKKQ序列见于3/8候选，较短LQLKKQ见于6/8，LxLxK模式见于7/8；预测核心区富含Cys、Ser和Thr。RiPPMiner预测可变前导–核心切割位点和3–6个潜在硫醚交联，但均为计算预测、未实验验证。该推定BGC缺乏明确可识别的专用lanP蛋白酶及簇相关典型lanRK调控和lanIEFG免疫基因；邻近ORF编码预测转录调控因子、转运蛋白、肽酶和其他辅助蛋白；LanB介导脱水、LanC介导环化和LanT相关输出为生物信息学推断模型，前导肽切割机制和成熟产物结构仍未解析。3.4 初步抗菌活性与靶向LC-MS筛选：SUN106^T粗提物对Bacillus subtilis KCTC 3135产生13.6 ± 1.1 mm抑菌圈（n=3），万古霉素阳性对照为20.6 ± 0.6 mm；对Escherichia coli CCARM 1G440、Candida albicans KCTC 7270和Staphylococcus aureus CCARM 3095在测试条件下未见清晰抑菌圈；现有数据不能将活性特异性归因于推定羊毛硫肽BGC。对培养上清、细胞结合和裂解物组分分别进行靶向UPLC–QTOF–MS筛查，理论上m/z按预测产物计算；因初步直接进样在ctg5_102核心理论[M+3H]3+和[M+4H]4+离子m/z 1111.1813和833.6378附近见低强度信号而优先考察ctg5_102，但LC分离提取离子分析未发现满足色谱、同位素间距和电荷状态联合标准从而支持该归属的特征；八个候选和所检组分中无成熟核心或前体相关特征满足预设MS1筛选标准。讨论部分总结：两株菌的多相分类支持两个新种；SUN106^T虽与F. profundus 16S rRNA基因相似性99.71%，但ANI和dDDH低于常用物种边界，说明基因组相关性可与表型/化学分类证据共同支持物种界定；七株Ferruginibacter基因组G+C范围在此比较数据集中并非异常宽泛，G+C变异本身不能确立物种边界或解释其进化原因。SUN106^T位点含lanB、lanC、lanT及8个相邻候选LanA样前体ORF，支持其注释为推定I类羊毛硫肽系统；8个候选阵列相对较大但并非空前，局部重复后序列分化是可能解释，但其进化起源未确定。该位点缺乏明确专用lanP、lanRK和典型lanIEFG免疫基因，并不确立通路不受调控或无活性；表达可能依赖宿主调控因子，内源外排或抗性机制可能支持自我防护，或通路功能不需典型抗生素免疫；附近调控因子和转运蛋白为待研究候选，但加工酶身份及SUN106^T LanT蛋白酶活性未验证。粗提物抑制B. subtilis的活性成分未鉴定，不能归于推定BGC；LC–MS筛选结果不证明羊毛硫肽生物合成在生物学上不存在，培养依赖表达、前体切割与脱水不确定性、提取回收或电离差异均可能影响检测；无诊断性MS/MS或标准品时产物结构与归属仍未解析。局限性包括泛基因组仅含七株Ferruginibacter基因组、BGC详细分析集中于SUN106^T、三个LC–MS组分来自同一培养物的两个50 mL等分样而无独立生物重复培养、未进行遗传验证；未来需更广泛基因组取样、重复代谢物分析、转录测量、靶向LC–MS/MS及遗传或异源验证。研究结论（译）：多相分类学分析支持将SUN002^T和SUN106^T分别提议为Ferruginibacter aquae sp. nov.和Ferruginibacter aurantiacus sp. nov.。比较基因组学揭示了基因内容变异，并在SUN106^T中鉴定出一个含8个候选前体ORF的推定I类羊毛硫肽BGC。在测试条件下，其预测产物仍未获得化学验证。这些发现拓宽了Ferruginibacter已记录的多样性，并为研究淡水细菌中前体多样化与成熟提供了明确的生物合成位点。