兰州百合LdERF基因亚家族全基因组分析及LdERF179调控小鳞茎再生的功能解析

《Plants》：Genome-Wide Analysis of the LdERF Gene Subfamily and Functional Characterization of LdERF179 During Bulblet Regeneration in Lilium

　　

AP2/ERF（APETALA2/乙烯响应因子）转录因子家族在植物生长、发育、胁迫响应以及器官再生中发挥关键作用。本研究对兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）ERF亚家族进行了全基因组综合分析，并进一步研究了候选基因LdERF179在小鳞茎再生中的功能作用。共鉴定到206个LdERF基因，并分析了其系统发育进化、染色体分布、基因结构、保守基序、顺式调控元件及共线性。表达模式分析提示，LdERF基因在小鳞茎再生过程中呈现6种表达模式，并表现出组织特异性和阶段特异性表达特征。LdERF179在再生起始（RI）阶段（S1）高表达，提示其可能参与鳞茎再生的早期形态发生。亚细胞定位分析表明LdERF179蛋白定位于细胞核。病毒诱导基因沉默（VIGS）功能验证结果显示，抑制LdERF179使小鳞茎形成效率由40.67%显著降至9.43%。进一步的表达分析表明，参与生长素生物合成、运输和信号传导的一些关键基因以及一些再生相关基因在TRV2-LdERF179中表达下降，而在LdERF179-OE（过表达）中LdASA1、LdAUX1、LdWOX11表达增加。因此，研究人员提出LdERF179通过调控生长素代谢相关基因和关键再生基因的表达影响小鳞茎再生的形态发生。然而，尚需进一步功能验证以阐明LdERF179如何调控生长素代谢基因和关键再生基因。本研究为百合小鳞茎再生的分子调控网络提供了新见解，并为提高百合营养繁殖效率提供了潜在候选基因。

研究背景与意义：兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）为多年生单子叶草本，鳞茎兼具食用、药用和观赏价值，也是营养繁殖的主要器官；但其自然繁殖系数低、栽培周期长，鳞片扦插仍是商业生产的主要方式，且受环境条件影响较大。离体小鳞茎再生是快速繁殖和优良种质扩繁的重要途径，再生效率是繁殖成功的关键限制因子。AP2/ERF（APETALA2/乙烯响应因子）超家族是植物最大且功能多样的转录因子（TFs）家族之一，ERF亚家族参与生长发育、激素信号和逆境响应，并在拟南芥等模式植物中参与组织再生；然而，百合中ERF在小鳞茎再生中的作用，尤其是不同再生阶段相关LdERF成员及其潜在调控网络仍不清楚。因此，研究人员开展全基因组鉴定并对候选基因LdERF179进行功能表征，以解析其在小鳞茎再生中的可能作用，为提升百合营养繁殖效率提供候选基因。

关键技术方法：研究人员利用兰州百合基因组（CNSA登录号CNA0139751，CNGBdb）以HMM和BLASTP鉴定ERF亚家族，并用SMART、CDD、Pfam验证AP2结构域；用TBtools进行染色体定位、MCScanX共线性、MEME基序和PlantCARE顺式元件分析，用MEGA 11以最大似然法（ML）构建系统发育树。表达分析采用小鳞茎再生S0–S4转录组（PRJCA060256）和六组织转录组（PRJCA068453），并以RT-qPCR验证；材料为福建农科院生物技术研究所的健康兰州百合鳞茎。亚细胞定位采用洋葱表皮瞬时表达；功能验证采用病毒诱导基因沉默（VIGS，TRV2-LdERF179）和pCAMBIA1301介导的过表达，结合表型统计、RT-qPCR和石蜡切片；统计采用GraphPad Prism进行t检验和单因素方差分析。

研究结果：2.1 兰州百合ERF亚家族的全基因组鉴定：通过HMM、BLASTP及保守域验证，从基因组中鉴定206个LdERF，均具完整AP2结构域和开放阅读框（ORF）；蛋白长度95–543 aa，分子量10.51–60.89 kDa，pI（等电点）4.37–11.49，GRAVY（总平均亲水性）均为负值，多数预测为不稳定蛋白；WoLF PSORT预测LdERF179可能核定位。结论是LdERF179具备进一步功能研究的候选特征。2.2 系统进化：通过206个LdERF与拟南芥ERF蛋白的最大似然法（ML）建树，LdERF分为8个进化支，ERF V成员最多，ERF Xb-L最少；部分与拟南芥同源蛋白聚类，部分为百合特异扩张。结论是LdERF家族存在保守性和谱系特异扩张。2.3 染色体分布与共线性：通过染色体定位和共线性分析，206个LdERF不均匀分布于12条染色体，LG02最多并含28个基因的簇，LG05仅5个；与拟南芥有2对、与水稻有6对直系同源。结论是LdERF染色体分布不均且部分基因在进化中保留。2.4 基因结构、保守结构域和保守基序：通过基因结构、保守域和MEME基序分析，多数LdERF含1–5个外显子，145个为单外显子，22个具超长内含子；所有蛋白含AP2结构域；鉴定10个保守基序，Motif 1和2在多数成员中对应AP2保守区。结论是LdERF基因结构较简单但存在变异，AP2结构域高度保守。2.5 顺式调控元件：通过PlantCARE分析，206个LdERF启动子含生长发育、激素、光和逆境响应元件；对141个含生长发育和Me-JA（茉莉酸甲酯）响应元件者进一步分析，光响应元件最多，其次为逆境和激素响应元件；LdERF131以生长素响应元件为主（29个），LdERF61和LdERF62以MeJA响应元件为主（12个），LdERF179和LdERF181含MeJA和发育相关元件；同亚组成员元件组成相似。结论是LdERF可能参与激素、逆境和发育调控。2.6 组织特异性及小鳞茎再生相关表达模式：通过‘Siberia’转录组（参照兰州百合基因组注释）分析，85个LdERF在组织中可检测，68个在再生中差异表达；组织和再生过程各呈现6种表达谱；LdERF179在S0–S2早期较高，在鳞片基部和花组织较高、叶和茎较低；RT-qPCR验证9个基因，LdERF67和LdERF95在S1–S2达峰，LdERF169在S4上调，LdERF116和LdERF196呈阶段特异表达；据此选择LdERF179。结论是LdERF成员具有组织特异性和阶段特异性表达，LdERF179与早期再生相关。2.7 LdERF179亚细胞定位：通过35S::LdERF179-eGFP在洋葱表皮瞬时表达并与DAPI（一种核染料）核标记共定位，LdERF179-eGFP荧光完全位于细胞核，细胞质无明显信号。结论是LdERF179定位于细胞核，符合转录因子特征。2.8 沉默LdERF179抑制兰州百合小鳞茎再生：通过TRV2-LdERF179 VIGS，PCR确认TRV CP（外壳蛋白）并以致RT-qPCR确认沉默；沉默后小鳞茎再生频率由40.67%降至9.43%，石蜡切片显示对照鳞片基部有紧密分生突起，而沉默组细胞松散增大、突起形成有限；LdASA1、LdIAA27、LdAUX1、LdWOX11和LdPIN1表达下降。结论是LdERF179参与小鳞茎再生，并可能与细胞增殖和再生结构起始相关；但表达变化不证明直接转录调控。2.9 过表达LdERF179上调生长素代谢相关基因和关键再生基因：通过pCAMBIA1301介导的35S::LdERF179过表达（OE），PCR检测Hyg/GUS、RT-qPCR确认过表达；与空载体（EV）相比，LdASA1、LdWOX11和LdAUX1表达增加，LdAUX1约增加10倍；但未获得过表达小鳞茎再生表型定量数据，不能仅凭表达变化断定过表达促进再生，直接调控关系仍待确定。

讨论部分总结：讨论指出，兰州百合基因组中206个LdERF数量较多，可能与其约36.68 Gb的大基因组、丰富重复序列和超长内含子有关；LdERF在12条染色体上分布不均并成簇。系统发育分8个亚组，同亚组基序和结构相似，Motif 1和7对应AP2 DNA结合域，其他基序可能参与转录激活/抑制、核定位和蛋白稳定性等功能分化。启动子元件提示LdERF响应光、ABA、MeJA和生长素等信号。ERF成员在植物再生中已有证据，LdERF179在再生早期高表达，类似AtERF115和AtWIND1在损伤后促进细胞重编程和再生；VIGS降低再生频率、过表达上调生长素及再生相关基因、组织学改变支持其正调控作用，并与Dendrobium officinale ERF5和OsERF71等再生功能部分保守。LdERF179可能影响ASA1、AUX1、IAA27、WOX11和PIN1等组成的生长素与再生网络，但现有结果主要基于沉默和过表达后的表达变化，尚不能证明直接调控，需启动子结合和转录激活实验验证。

研究结论翻译：本研究从兰州百合基因组中系统鉴定206个LdERF基因；系统发育、基因结构、保守基序、染色体分布、共线性和顺式调控元件等综合分析揭示了LdERF基因家族的进化特征和结构多样性。表达谱表明LdERF基因广泛参与小鳞茎再生和组织发育，LdERF179在小鳞茎诱导早期表达较高。功能分析进一步表明，沉默LdERF179明显抑制小鳞茎再生，而过表达LdERF179上调生长素相关基因和再生相关基因，如LdASA1、LdAUX1、LdIAA27、LdWOX11和LdPIN1。这表明LdERF179可能通过协调生长素信号与再生相关调控通路促进小鳞茎再生；LdERF179调控生长素代谢的具体机制尚需进一步深入功能验证。总体而言，本研究全面表征了兰州百合LdERF基因家族，LdERF179被认为是提高再生效率及用于分子育种的潜在候选基因；LdERF179可能通过协调生长素信号与再生相关调控通路促进小鳞茎再生，后续研究可进一步探究LdERF179如何调控生长素代谢通路以控制鳞茎再生。这些发现为小鳞茎再生的分子机制提供了有价值见解，并为提高百合再生效率及发展遗传转化和分子育种策略提供了有前景的候选基因。