致病性副溶血弧菌VTc毒素的快速纯化、生物活性鉴定与分子组成表征

《Toxins》：Rapid Purification and Molecular Characterization of VTc Toxin from Pathogenic Vibrio parahaemolyticus

　　

高致死性弧菌病（HLVD）是一种由产VTc毒素的弧菌菌株引起的新发对虾疾病，命名为VHLVD。VTc毒素由VTcA、VTcB和VTcC亚基组成，是Tc毒素家族的新成员。VTc毒素的结构与功能研究因缺乏高效纯化方案而受到限制。在此，研究人员建立了一种通过阴离子交换层析纯化毫克级具有生物活性VTc毒素的简便方法。对细胞裂解、样品预处理和阴离子交换层析流程进行了优化。该方案从40 mL细菌培养物（VHLVD菌株vp-HL-202005）中获得约1.5 mg高纯度毒素。产物组成通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）确认。纯化的VTc毒素具有生物活性，可诱导凡纳滨对虾后期幼体出现典型HLVD死亡。透射电子显微镜（TEM）和天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）分析揭示了两种不同的结构群体，可能分别代表棒状全毒素（VTcA₂-VTcB₂-VTcC₂）和钟形VTcA₂同源五聚体。这种简单高效的方法将极大促进VTc毒素精细结构和功能机制研究，从而拓展对Tc毒素家族的认识。

高致死性弧菌病（HLVD，一种新发对虾疾病）由产VTc毒素的弧菌菌株引起，相关菌株称为VHLVD。VTc毒素由VTcA、VTcB和VTcC亚基组成，是Tc毒素家族（Tc toxin family，三组分注射器样细菌毒素复合物）的新成员。该病于2019年末首次出现于中国东南沿海凡纳滨对虾苗场并扩散，主要危害后期幼体和早期养成阶段，可造成肝胰腺小管和中肠上皮损伤，爆发池后期幼体2—3天内死亡率可达90%。VTc毒素被证明是HLVD的主要致病因子。VHLVD菌株含两个质粒毒素基因簇：pHLB携带vtca1、vtcb1和vtcc1，pHLC携带vtca2、vtcb2、vtcc2和vtcc3；两个VTcA亚基同源性89%，两个VTcB亚基同源性97%，三个VTcC亚基的高变区（HVR）同源性低于15%。这些亚基是否组装为单一毒素复合物还是多个不同复合物、何种亚基组合构成功能毒素仍不清楚。VTc毒素作为Tc毒素家族新成员，其功能机制研究不足，而高纯度毒素是精细结构与功能表征、理解其与宿主靶标相互作用所必需。此前研究人员已建立VTc毒素部分纯化方法，但基于超声的流程需极小心和快速操作，因为超声破坏细胞区室，使目标蛋白与内源蛋白酶共同释放至可溶组分，毒素易被降解。为此，研究人员开发了简便快速的溶菌酶法纯化VHLVD菌株VTc毒素，并从纯度、产量、生物活性和基本结构方面对产物进行表征。研究结论是：该溶菌酶结合阴离子交换层析的流程可从少量弧菌培养物获得毫克级高纯度、结构较完整且具生物活性的VTc毒素，纯度由超声法的27.97%提高至83.58%，产量约1.5 mg/40 mL，与超声法约1.7 mg/40 mL相近；纯化产物主要为pHLC编码的VTcA₂、VTcB₂和VTcC₂组成的全毒素及VTcA₂寡聚体，pHLB贡献可忽略。该工作为VTc毒素精细结构、功能机制及HLVD致病机制研究提供了关键材料。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员比较超声与溶菌酶裂解，优化裂解、洗涤、提取和缓冲体系，采用阴离子交换层析纯化，并以SDS-PAGE、LC-MS/MS、native PAGE和TEM表征，用凡纳滨对虾后期幼体浸浴攻毒评价活性。样本来源包括：2020年5月自中国福建HLVD患病虾分离的VHLVD菌株vp-HL-202005（保藏号MCCC1A19199）；2019年11月自健康虾分离的非致病菌株vp-201911（保藏号MCCC1A18640）；含pHLA和pHLC而缺失pHLB和pHLD的突变株vp-HL-202005-pHLAC；对虾后期幼体由厦门鑫荣腾水产提供。

研究结果如下。2.1 超声与溶菌酶细胞裂解的比较：通过SDS-PAGE比较两种裂解方式，发现超声使VTc毒素和多种胞内蛋白共同释放至可溶上清；而10 mg/mL溶菌酶在0.5% Triton X-100存在下使VTc毒素保持细胞相关状态，多数非靶蛋白释放至胞外，经简单离心即可去污，随后高盐条件可回收细胞相关VTc毒素，故选择溶菌酶法进一步优化。2.2 溶菌酶法粗提VTc毒素的优化：2.2.1 Triton X-100和EDTA对溶菌酶裂解的影响：通过不同组合处理并SDS-PAGE分析，发现单用Triton X-100或Triton X-100+溶菌酶可释放大量细胞蛋白而VTc毒素多保持细胞相关；加入10 mM EDTA（乙二胺四乙酸，EDTA）会使VTc毒素从细胞解离，降低后续可纯化量；0.5% Triton X-100+溶菌酶在去污与VTc毒素回收间平衡较好。2.2.2 溶菌酶浓度优化：通过1—10 mg/mL溶菌酶处理，发现低浓度可使VTc毒素释放，3—5 mg/mL时裂解上清无VTc毒素但洗涤时部分解离，6—10 mg/mL时VTc毒素在整个流程中主要保持细胞相关，回收和去污最佳，故采用10 mg/mL。2.2.3 缩短粗提VTc毒素所需时间和步骤：通过依次优化裂解、洗涤和提取时间，确定10 mg/mL溶菌酶裂解20 min、两次10 min洗涤、两次10 min提取为最省时方案，粗提可在2 h内完成。2.2.4 缓冲体系优化：比较TN缓冲体系与标准磷酸盐缓冲液（PBS，磷酸盐缓冲液），发现二者提取效率相当，PBS的SDS-PAGE背景略清洁，提示粗产物更纯和/或蛋白降解更少；最终粗提流程为PBS体系中溶菌酶裂解、洗涤和2×PBS提取。2.3 阴离子交换层析纯化具生物活性VTc毒素：通过阴离子交换层析及SDS-PAGE/LC-MS/MS分析，纯化产物含VTcA、VTcB和VTcC₂-RHS主要条带，以及VTcC₂-HVR小片段，提示VTcC发生自裂解；次要条带为细菌伴侣蛋白GroEL、VTcA降解片段和谷氨酸-氨连接酶（GlnA，谷氨酸-氨连接酶）。LC-MS/MS显示vp-HL-202005中VTcC₂占优，约为VTcC1的80倍，VTcC3未检出，终产物主要为VTcA、VTcB和VTcC₂组成的复合物。浸浴攻毒显示纯化VTc毒素和粗提物高毒，48 h内分别引起100%和>70%死亡，裂解上清和洗涤上清死亡率<3.5%，与阴性对照相近，表明获得高纯且具生物活性的VTc毒素。2.4 溶菌酶法与超声法纯化VTc毒素的比较：通过产率、纯度和攻毒比较，两法产量相近，但溶菌酶法产物 consistently 显示VTcA、VTcB、VTcC₂-RHS和VTcC₂-HVR四条主要条带，超声法降解产物和不相关蛋白更多；ImageJ定量显示纯度由27.97%提高至83.58%，约提高四倍。两法制备毒素在浸浴攻毒中致病性相似，但原文指出可能因超声降解片段仍部分有功能或挑战剂量过高饱和，不能解释为产品质量等同；溶菌酶法因目标蛋白富集于沉淀/细胞碎片组分而与可溶蛋白酶分离，故对操作时间与速度不敏感，批间变异更小。2.5 纯化VTc毒素的表征：通过native PAGE结合LC-MS/MS和SDS-PAGE，发现纯化产物含两种复合物：高分子量复合物1含VTcA₂、VTcB₂、VTcC₂-RHS和VTcC₂-HVR，低分子量复合物2主要为VTcA₂；野生型vp-HL-202005与pHLB缺失突变株vp-HL-202005-pHLAC组成相似，表明产物主要来自pHLC编码的vtc位点，pHLB贡献可忽略。TEM显示两种颗粒：多数为长约34 nm、宽约16 nm的棒状颗粒，少数为长约24 nm、宽约16 nm的钟形颗粒；据已知Tc毒素结构暂将棒状颗粒归为VTcA₂-VTcB₂-VTcC₂全毒素，钟形颗粒归为VTcA₂同源五聚体，并指出需冷冻电子显微镜（cryo-EM）进一步验证。TEM未见明显碎片，提示产物纯度较高。

讨论部分总结：原文指出，纯化VTc毒素虽引起高死亡率，但死亡发生较等量毒素的活菌感染延迟；活菌可持续产毒形成更高累积剂量，活菌递送毒素机制尚不清楚，副溶血弧菌其他毒力因子可能协同作用，纯化过程中全毒素部分解离也可能降低活性；此外，纯化产物仍含低水平GroEL和GlnA，不能完全排除其对虾死亡贡献。超声法与溶菌酶法产物攻毒致病性相似，可能因超声降解片段仍部分有功能或剂量过高饱和，不能视为质量等同。TEM颗粒归属为暂定，需cryo-EM验证。结论部分译文：本研究报道了一种简化的阴离子交换流程，可从少量弧菌培养物产生毫克级高纯度、具生物活性的VTc毒素。VTc毒素纯化方案概述为：过夜培养收获的弧菌细胞在0.5% Triton X-100存在下经10 mg/mL溶菌酶裂解；离心去除含非靶蛋白的上清；含VTc毒素沉淀用1×PBS洗涤两次；随后用2×PBS提取两次；粗毒素提取物经阴离子交换层析纯化；全过程可在4 h内完成。该简便方法将支持VTc毒素结构与功能的未来研究，并提高对HLVD发病机制的理解。