《International Journal of Nanomedicine》：Targeted Delivery of Mdivi-1 via RVG-Functionalized Extracellular Vesicles for Mitochondrial Protection in Ischemic Stroke
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背景：线粒体功能障碍是缺血性脑卒中后神经元死亡的主要驱动因素，可促进过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、炎症反应及凋亡信号，从而加剧继发性脑损伤。Mdivi-1已显示出线粒体保护及神经保护潜力，但其临床转化受限于在缺血脑
背景：线粒体功能障碍是缺血性脑卒中后神经元死亡的主要驱动因素，可促进过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生、炎症反应及凋亡信号，从而加剧继发性脑损伤。Mdivi-1已显示出线粒体保护及神经保护潜力，但其临床转化受限于在缺血脑组织中蓄积不足、所需全身剂量较高以及相关脱靶毒性。本研究旨在开发一种神经元靶向细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）递送系统，以增强Mdivi-1向缺血脑组织的靶向递送。方法：通过生物正交点击化学将狂犬病病毒糖蛋白肽（rabies virus glycoprotein peptide, RVG29）功能化修饰至EVs表面，构建神经元靶向的RVG-EVs。随后将Mdivi-1装载至RVG-EVs中，并对制剂的粒径、稳定性及载药效率进行表征。体外培养HT22细胞并置于氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）条件下，以评估RVG-EV-Mdivi-1的治疗潜力。体内研究中，采用小鼠短暂大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）模型，考察生物分布、梗死体积、神经功能结局、线粒体功能障碍、氧化应激及凋亡相关信号通路。结果：RVG-EVs表现出增强的神经元摄取能力；在OGD条件下，RVG-EV-Mdivi-1可显著减轻线粒体碎片化及ROS蓄积，从而保护线粒体功能与细胞生物能量平衡。在tMCAO小鼠中，荧光标记EVs的生物分布分析显示，与未修饰EVs相比，RVG功能化EVs及RVG-EVs-Mdivi-1的脑内蓄积和神经元靶向性均显著增强。与游离Mdivi-1相比，系统给予RVG-EV-Mdivi-1可在较低Mdivi-1剂量下产生显著的神经保护效应，减少梗死体积并改善神经功能结局。此外，RVG-EV-Mdivi-1减轻了缺血性损伤，并调节线粒体及凋亡相关通路，表现为Drp1和Bax表达降低，Bcl-2水平恢复。结论：本研究证实，RVG功能化EVs为Mdivi-1的靶向递送提供了一种有前景的策略，可增强脑内蓄积及神经元摄取，同时减轻缺血性脑卒中后的线粒体氧化损伤和神经元损伤。上述发现支持RVG-EV介导的Mdivi-1递送作为一种神经元靶向且可减少剂量的缺血性脑卒中治疗策略。
缺血性脑卒中后，线粒体功能障碍是驱动神经元损伤与继发性脑损害的核心病理环节。脑缺血再灌注过程中，过量活性氧（ROS）生成、ATP合成障碍及凋亡信号通路激活共同导致神经元死亡。线粒体分裂相关蛋白DRP1（dynamin-related protein 1）在缺血应激下异常活化，引发线粒体过度碎片化、膜电位丧失及促凋亡因子释放，是介导线粒体损伤的关键分子。Mdivi-1作为DRP1抑制剂，在多种缺血模型中展现出神经保护潜力，但其水溶性差、体内清除快、缺血脑区蓄积不足及脱靶毒性等问题严重制约其临床转化。因此，开发能够跨越血脑屏障（BBB）并实现神经元特异性递送的载体系统，是提升Mdivi-1治疗窗与安全性的关键策略。细胞外囊泡（EVs）因其固有生物相容性、可穿越BBB能力及可工程化修饰特性，成为理想的药物递送平台。研究人员将狂犬病病毒糖蛋白肽（RVG29）通过无铜点击化学偶联至骨髓间充质干细胞来源EVs表面，构建神经元靶向载体RVG-EVs，并装载Mdivi-1形成RVG-EV-Mdivi-1，旨在通过nAChR介导的主动靶向增强药物在缺血脑组织的蓄积与神经元内摄取，同时降低全身药物暴露剂量。
研究人员从C57BL/6小鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞（BMSCs），采用差速超速离心法提取EVs，并通过NHS-PEG4-DBCO与叠氮修饰RVG29之间的无铜点击化学反应完成表面功能化。利用透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）及Western blot对EVs形态、粒径、电位及标志蛋白进行表征。通过孵育结合温和超声法提高Mdivi-1载药效率，并评估其体外释放曲线与稳定性。体外实验中，以小鼠海马神经元HT22细胞建立氧糖剥夺（OGD）模型，检测细胞活力、ROS水平、线粒体膜电位（ΔΨm）及ATP含量。体内实验中，采用雄性C57BL/6J小鼠短暂大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型，在再灌注时经尾静脉注射不同制剂，利用活体成像系统（IVIS）评估DiR标记EVs的生物分布与脑靶向性，通过免疫荧光染色分析神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞对PKH26标记EVs的摄取差异；通过甲酚紫染色测定脑梗死体积，采用改良神经功能严重程度评分（mNSS）、转棒实验（EBST）及悬挂线实验评价神经行为恢复；Western blot检测DRP1、Bax、Bcl-2蛋白表达；通过H&E染色、血常规及血清生化指标评估体内生物安全性。
研究结果如下：
（1）BMSCs与EVs表征：分离的BMSCs呈典型梭形形态，高表达CD73和CD105，低表达CD45和CD34，符合间充质干细胞表型。EVs呈典型杯状形态，粒径分布于40–150 nm，表达CD63和TSG-101，不表达GM130，纯度良好。荧光共定位证实RVG成功偶联至EVs表面，zeta电位轻度正向偏移。孵育联合超声可使Mdivi-1包封率由22.15%±6.28%显著提升至45.23%±8.81%。
（2）EVs表征、药物释放与摄取效率：RVG修饰未改变EVs形态、粒径及标志蛋白表达。Mdivi-1从EVs中呈现双相控释特征，24小时内释放约50%，其后持续缓慢释放。RVG-EV-Mdivi-1在4°C PBS中储存一周后粒径无显著变化。体外摄取实验中，RVG-EVs在HT22细胞中的内化效率较未修饰EVs显著提高（P=0.001），表明RVG修饰通过神经元nAChR介导的胞吞作用增强细胞摄取。
（3）体外细胞相容性与抗缺血效应：HT22细胞与RVG-EV-Mdivi-1共孵育6小时，在0–20 μM浓度范围内细胞活力维持在95%–100%，表明制剂具有良好的细胞相容性。在OGD模型中，EV载药组在较低浓度下即显著恢复细胞活力，且RVG-EV-Mdivi-1的促存活效果优于游离Mdivi-1。OGD导致ROS显著升高，而RVG-EV-Mdivi-1处理组ROS降幅最为明显，并显著抑制细胞死亡。JC-1染色显示，OGD导致线粒体膜电位下降，RVG-EV-Mdivi-1处理后红色荧光/绿色荧光比值恢复至接近正常水平，同时ATP含量显著回升，提示线粒体生物能量功能得到有效保护。
（4）体内生物分布与细胞靶向：在tMCAO小鼠中，DiR标记的RVG-EVs及RVG-EV-Mdivi-1在缺血脑区的蓄积较未修饰EVs增加约2倍，而外周器官分布模式与天然EVs一致，以肝脏和肠道为主。细胞摄取分析显示，RVG-EVs在缺血区内神经元中的摄取量较小胶质细胞和星形胶质细胞高出约4倍，证实RVG修饰赋予EVs显著的神经元靶向偏好。
（5）治疗功效与神经功能恢复：与PBS对照组相比，游离Mdivi-1和EV-Mdivi-1仅中度减小梗死体积；RVG-EV-Mdivi-1处理使梗死体积较对照组减少约70%，较游离Mdivi-1或EV-Mdivi-1减少约50%。行为学测试显示，RVG-EV-Mdivi-1组小鼠mNSS评分显著降低，EBST偏向指数改善，悬挂时间延长，且在第14天几乎恢复至假手术组水平，体重变化无明显差异，表明治疗显著促进神经功能恢复。
（6）神经保护机制与生物安全评价：tMCAO后脑组织DRP1和Bax表达上调、Bcl-2表达下调；RVG-EV-Mdivi-1处理显著逆转上述变化，且效果优于非靶向EV-Mdivi-1及游离药物，表明其通过抑制线粒体分裂和抗凋亡通路发挥神经保护作用。H&E染色示主要器官（脑、心、肺、肝、肾、脾）未见组织损伤或炎症浸润；血常规及血清生化指标（肝、肾功能标志物）与对照组无显著差异，显示制剂具有良好的体内生物相容性。
讨论部分指出，RVG-EV-Mdivi-1通过无铜点击化学实现EVs表面修饰，避免了遗传工程可能带来的基因组不稳定或免疫原性风险，也规避了铜催化反应对EVs完整性的潜在损伤。该递送策略在0.25 mg/kg的Mdivi-1剂量下即产生显著疗效，远低于本研究游离药物组使用的1 mg/kg及既往文献报道剂量，体现出剂量节省优势。研究人员同时指出研究存在以下局限：RVG介导的摄取机制未通过受体阻断实验验证；DiR荧光反映的是EV载体分布而非Mdivi-1的直接组织定量；亲脂性染料可能产生非特异性信号；线粒体及线粒体自噬相关通路分析尚需深入；样本量有待扩大；仅采用雄性动物模型，未能覆盖性别、年龄及合并症等影响因素。
研究结论：研究人员设计了RVG-EVs介导的Mdivi-1靶向递送系统，用于预防缺血性脑损伤后的线粒体损害并增强神经保护。RVG功能化提高了Mdivi-1载药EVs的脑内蓄积和神经元摄取；RVG-EV-Mdivi-1能够减轻线粒体功能障碍、抑制过量ROS生成并增强ATP产生，进而减少实验性卒中小鼠的梗死体积并改善神经功能结局。该治疗效应在低于游离药物的Mdivi-1剂量下即可实现，支持其作为剂量节省型递送平台的潜力。体内外实验均证实RVG-EV-Mdivi-1具有良好的生物安全性和相容性。综上，RVG-EV-Mdivi-1代表了一种有前景的缺血性脑卒中后神经元靶向线粒体保护与神经保护策略，未来仍需通过直接药物生物分布测定、更大动物队列及更详细的机制验证来推进其临床转化。
