微环境触发序贯靶向胶束经ROS响应性Rg1释放与HAP-1介导Celastrol递送双调控巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞治疗类风湿关节炎

《International Journal of Nanomedicine》：Microenvironment-Triggered Sequentially Targeted Micelles for Dual Regulation of Macrophages and Fibroblast-Like Synoviocytes via ROS-Responsive Rg1 Release and HAP-1-Mediated Celastrol Delivery in Rheumatoid Arthritis Therapy

　　

摘要

引言：侵袭性成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLS）的过度增殖和持续性滑膜炎症不可避免地驱动类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）的病理进展。能够实现对巨噬细胞和FLS双重调控的药物递送系统对RA治疗具有高度需求。

方法：研究人员制备了微环境触发序贯靶向胶束（HAP@CMR），共载人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1, Rg1）和雷公藤红素（celastrol, Cel），用于双重调控巨噬细胞和FLS。Rg1通过活性氧（reactive oxygen species, ROS）响应性连接子偶联于胶束表面。在ROS过表达的关节微环境中，ROS触发Rg1外壳裂解，暴露HAP-1靶向肽，促进FLS内吞并伴随选择性Rg1释放，从而抑制巨噬细胞介导的炎症。Cel通过暴露的HAP-1肽被FLS选择性内化，以抑制FLS增殖。

结果：体外实验中，HAP@CMR促使巨噬细胞由促炎M1表型向抗炎M2表型复极化，抑制炎性细胞因子分泌，并对FLS的增殖、迁移和侵袭发挥强效抑制作用。在大鼠胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）模型中，给予HAP@CMR在所有药物治疗组中引起最显著的足爪肿胀减轻。进一步的组织学、X射线和微计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT）评估证实，该治疗有效缓解滑膜炎症、减轻软骨侵蚀并抑制骨破坏。

结论：该新型纳米平台促进FLS凋亡，同时减轻局部炎症反应，为RA提供了一种有前景的治疗策略。

关键词：类风湿关节炎；成纤维样滑膜细胞；人参皂苷Rg1；雷公藤红素；靶向胶束

研究背景方面，RA为慢性自身免疫性疾病，主要病理特征包括滑膜增生、血管翳形成、免疫细胞浸润、关节软骨进行性破坏及功能障碍。现有治疗难点在于炎症细胞持续浸润与FLS异常增殖共同造成骨和软骨侵蚀，因此需要同时抑制炎症和滑膜增生的递送系统。巨噬细胞具有可塑性，RA关节内M1型巨噬细胞占优势可分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素（interleukin, IL）-1β和IL-6等促炎因子，而M2型巨噬细胞表达CD206、CD163并产生IL-4、IL-10和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）等抗炎因子；促进M1向M2复极化是潜在策略。FLS在RA中呈侵袭性表型，释放细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP），与巨噬细胞形成炎症放大环路。Rg1具有抗炎作用但水溶性差、生物利用度低、体内清除快；Cel可抑制FLS增殖、迁移和侵袭，但存在全身副作用、脱靶肝毒性和心脏毒性及治疗窗窄等问题。基于此，研究人员构建微环境触发序贯靶向胶束HAP@CMR，将Rg1经ROS响应性硫缩酮（thioketal, TK）连接子偶联于DSPE-PEG₂₀₀₀-TK-Rg1，利用RA炎症微环境高ROS裂解TK连接子释放Rg1并暴露HAP-1肽，实现Rg1调控巨噬细胞炎症和HAP-1介导Cel进入FLS抑制增殖的双重调控。

研究人员开展了HAP@CMR的制备、表征、体外巨噬细胞极化与FLS功能评价及CIA大鼠体内治疗研究。结论显示，HAP@CMR可在高ROS环境触发Rg1释放并暴露HAP-1，体外促使巨噬细胞由M1向M2复极化、抑制促炎因子并增强抗炎因子分泌，抑制FLS增殖、迁移、侵袭并诱导凋亡；CIA大鼠中HAP@CMR最显著减轻足爪肿胀、滑膜炎症、软骨侵蚀和骨破坏，且治疗剂量下生物安全性良好。该研究意义在于提出一种兼具炎症微环境响应、序贯靶向和巨噬细胞/FLS双重调控的RA纳米治疗策略。

关键技术方法概括（不超过250字）：采用薄膜分散法制备HAP@CMR，并以动态光散射、透射电镜、傅里叶变换红外光谱、紫外-可见光谱和高效液相色谱等表征；透析法考察ROS响应释放；以脂多糖激活RAW264.7细胞，采用免疫荧光、流式细胞术和酶联免疫吸附试验评价极化与细胞因子；以RA-FLS进行摄取、CCK-8、Annexin V-FITC/PI、活死染色、EdU、划痕和Transwell实验；建立CIA大鼠模型并进行活体成像、红外热成像、X射线、micro-CT、组织学和安全性评价。RA-FLS购自iCell，RAW264.7购自Procell，SPF级雌性SD大鼠购自辽宁长生，CIA模型于辽宁中医药大学动物中心建立。

研究结果：（1）Synthesis of DSPE-PEG₂₀₀₀-TK-Rg1：通过¹H NMR和FTIR证明DSPE、PEG₂₀₀₀、TK连接子和Rg1特征信号共存，并出现新的酯羰基吸收带，表明DSPE-PEG₂₀₀₀-TK-Rg1成功合成。（2）Characterization of Micelles：Tyndall效应、TEM、DLS、溶血、释放、稳定性和光谱分析显示HAP@CMR呈均匀球形，粒径167.05±9.22 nm、zeta电位?13.53±1.42 mV、多分散指数（polymer dispersity index, PDI）0.14±0.03；H₂O₂处理后发生聚集融合，溶血率<5%，并表现ROS响应性释放和30天储存稳定性，Cel被有效包载。（3）Macrophage Polarization：免疫荧光和流式细胞术显示，HAP@CMR+H₂O₂组CD86⁺比例为20.5±0.6%，低于模型组73.8±0.8%；CD206⁺比例为73.2±1.8%，高于模型组27.0±1.2%，表明促M1向M2复极化。（4）Determination of Inflammatory Cytokines：ELISA显示HAP@CMR+H₂O₂降低TNF-α和IL-1β，升高TGF-β和IL-10，逆转脂多糖所致炎症微环境失衡。（5）Cytotoxicity and Apoptosis Assessment：CCK-8、活死染色和Annexin V-FITC/PI显示游离Cel的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）最低（1.02±0.06 μM），HAP@CMR为4.16±0.22 μM，HAP@CMR+H₂O₂为2.98±0.15 μM；HAP@CMR+H₂O₂凋亡率为25.95±2.62%，表明ROS依赖抑制FLS生长并诱导凋亡。（6）Inhibition of Proliferation, Migration, and Invasion：EdU、划痕和Transwell实验显示HAP@CMR+H₂O₂最强抑制FLS增殖、迁移和侵袭。（7）Cellular Uptake：荧光显微镜和流式细胞术显示HAP@Cou-MR+H₂O₂摄取最高，支持ROS触发去屏蔽后暴露HAP-1促进FLS内化；原文同时指出尚无直接肽标记可视化HAP-1暴露。（8）In vivo Biodistribution：CIA大鼠活体成像显示HAP@DiR-MR在炎症关节荧光强于DiR-Ms，并可持续至84 h，游离DiR靶向能力差。（9）Anti-Arthritic Effect in vivo：CIA大鼠治疗中HAP@CMR最显著减轻足爪肿胀和关节热信号，X射线显示骨侵蚀减轻，血清TNF-α和IL-1β降低、IL-10和TGF-β升高；micro-CT显示HAP@CMR改善骨密度、骨体积分数、骨表面积密度、骨小梁数目和厚度并降低骨小梁分离度。（10）Histology Analysis：H&E和甲苯胺蓝染色显示HAP@CMR减轻滑膜增生、炎症浸润、软骨侵蚀和血管翳侵袭；免疫荧光显示其降低MMP-3、MMP-9、纤连蛋白、波形蛋白和CD86，升高CD206。（11）Safety Assessment：血小板、血红蛋白、红细胞、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和尿素氮水平与正常相近，主要器官H&E未见明显系统毒性，治疗剂量1 mg/kg下生物安全性良好。

讨论部分总结：原文指出游离Cel体外IC₅₀低于HAP@CMR，但体内疗效较差，原因与其水溶性差、系统清除快、非特异性分布和脱靶毒性有关，限制了其在炎症滑膜中的有效蓄积；HAP@CMR虽体外杀伤FLS能力较低，但可改善Cel水溶性、延长血液循环、实现炎症关节靶向富集并调控关节炎症微环境，从而在CIA大鼠中取得更好的关节保护效应。原文说明本研究主要聚焦细胞和组织水平表型，未提供信号蛋白免疫印迹数据，下游信号通路依据既有文献推测：Rg1可能通过上调PPAR-γ、抑制IκBα磷酸化而抑制NF-κB通路，Cel可能通过诱导G2/M细胞周期阻滞和凋亡、增加Bax/Bcl-2比值及激活Caspase-3/9抑制RA-FLS增殖。原文还指出，该胶束不同于巨噬细胞来源细胞外囊泡仿生系统，其通过ROS响应性Rg1释放和HAP-1介导Cel递送两个独立功能模块实现双重调控；体外释放仅用H₂O₂模拟ROS刺激，不能完全复现RA炎症环境中多种活性氧和活性氮物质，后续需纳入多种活性氧和活性氮物质；序贯靶向假设目前主要依赖间接细胞摄取证据，尚需荧光标记HAP-1提供直接证据。

研究结论翻译：本研究为RA治疗引入了一种新策略。既往许多研究尝试调控巨噬细胞或FLS，但多数现有策略局限于单一通路或简单叠加靶向模型。本研究构建了微环境触发序贯靶向胶束纳米载体，具有多项突出优势：（1）纳米载体通过外渗通过渗漏血管及随后炎症细胞介导的螯合（extravasation through leaky vasculature and subsequent inflammatory cell-mediated sequestration, ELVIS）效应在炎症部位精准蓄积；（2）Rg1在炎症关节内以刺激响应方式释放，减轻巨噬细胞来源炎症反应；（3）HAP-1表面修饰使Cel靶向递送至FLS并阻断其过度增殖；（4）对FLS和巨噬细胞表型的双重调控抑制炎症细胞浸润，并对滑膜破坏和骨侵蚀发挥保护作用。因此，所开发的HAP@CMR有望成为RA治疗的有效候选。