在不同持续时间的商业太空飞行中的微生物动态变化

《iScience》：Microbial dynamics across commercial spaceflights of varying duration

　　亮点
- 纵向分析显示肠道/口腔微生物组保持稳定，皮肤微生物组出现特定变化
- 受试者和身体部位对微生物组组成的影响大于环境因素
- 微生物组动态与飞行后短暂的免疫激活有关

摘要
太空飞行引入了环境压力因素，可能改变人体微生物组和免疫反应。我们分析了来自6名宇航员的259个和17个生物样本，这些样本来自两次商业国际空间站（ISS）任务：Axiom 2（10天任务）和Axiom 3（21天任务）。样本包括唾液、粪便、尿液以及来自10个解剖部位的体表拭子，通过16S核糖体RNA（rRNA）基因扩增子测序进行分析。肠道和口腔微生物组保持稳定，而皮肤相关菌群在飞行后表现出短暂的多样性变化。分类学分析揭示了个体和部位特异性模式，以及受太空飞行/ISS环境的影响。单细胞数据的细胞因子分析表明免疫系统被激活，Axiom 2和Axiom 3中IL-32和IL-16的转录本水平升高。微生物组与白细胞介素的相关性分析在Axiom 2数据中发现了14个显著关联。这些发现提供了关于微生物组个体差异的全面视角。我们的研究是对两次任务的描述性比较，为未来的长期太空任务中的宇航员健康提供了策略。

引言
太空飞行带来了独特的环境压力因素，这些因素会显著影响人体生理，包括微生物组。本研究在两次太空飞行任务中对人体微生物组进行了多次时间点的采样，记录了从地球到国际空间站（ISS）再返回过程中的微生物变化。在太空中，宇航员面临微重力、宇宙辐射、封闭环境以及无菌或半无菌条件。这些条件会扰乱人体微生物组的平衡和组成，导致微生物多样性、丰度和功能的变化。因此，了解微生物组如何应对这些压力对于制定维持其稳定性的对策至关重要。这对于宇航员的健康和表现尤为重要，特别是在前往月球或火星的长期任务中，因为医疗支持和补给资源有限。微生物组对人类健康至关重要，它参与关键生理功能，如营养消化、代谢处理、免疫系统调节和抵御病原体。白细胞介素（如IL-32和IL-16）是调节炎症和维持上皮屏障完整性的关键免疫介质，是理解太空飞行期间免疫调节的重要目标。微生物组在身体不同部位具有不同的组成和功能：肠道微生物组密度较高，主要参与代谢和免疫发展；口腔菌群与牙齿和全身健康相关；皮肤微生物组因水分和油脂含量而异，具有屏障防御作用；泌尿生殖道和泌尿道菌群密度较低，但在功能上具有重要意义。这种部位特异性反映了微生物群对独特环境生态位的适应，对于维持局部和全身稳态至关重要。

先前的研究已经开始揭示太空飞行对人类微生物组的影响，其中一些重要发现来自NASA的双胞胎研究和其他调查。NASA的双胞胎研究发现，在ISS上停留近一年的双胞胎与留在地球上的兄弟相比，其微生物多样性和组成发生了变化。Voorhies等人的其他研究表明，长期任务可能导致不同部位的微生物失调或恢复力。尽管如此，许多研究仍受样本量小（通常只有一到两个人）、研究部位有限或采样时间点少的限制。同样，Inspiration4任务在对四名个体进行为期3天的轨道飞行时，收集了10个部位的样本，并报告了皮肤相关微生物组的短期变化，而肠道和口腔菌群基本稳定，同时免疫信号通路也发生了协调变化。最近的研究还描述了与太空栖息地相关的微生物群，包括ISS和中国空间站，强调了环境微生物组成、功能潜力以及与航天器相关的生态动态。虽然这些研究为太空飞行中的宿主相关和环境微生物组提供了有价值的见解，但它们在捕获纵向数据、限制的身体部位采样和缺乏综合免疫分析方面存在不足。本研究分析了两次商业ISS任务中的微生物组，分别是持续10天的Axiom 2（Ax-2）任务和持续21天的Axiom 3（Ax-3）任务。重要的是，本研究在方法学和概念上相比之前的太空飞行微生物组研究有所改进。具体而言，我们利用了两次不同持续时间（10天和21天）的独立商业ISS任务的多部位、纵向采样，不仅分析了唾液、粪便和尿液，还更广泛地描述了十个解剖部位的微生物组动态。此外，跨任务的比较设计为研究太空飞行前3周内的微生物组和单细胞免疫反应提供了独特的机会，这是一个在人类太空生物学中相对较少研究的时期。通过整合16S rRNA基因测序和单细胞转录组分析，这项工作提供了微生物动态和宿主免疫激活的结合视角。总体而言，这项研究为理解密闭太空飞行环境中的宿主-微生物相互作用提供了一个假设生成框架。尽管这两次任务在持续时间上有所不同，但研究旨在提供两种不同飞行环境下的描述性比较，反映了机组人员组成、个体差异和任务环境的综合影响。Ax-2任务有4名宇航员，而Ax-3任务有2名宇航员。这种设计使我们能够比较6名宇航员在10天和21天任务期间10个身体部位的微生物组，从而提供了太空飞行前3周内人体微生物组变化的初步视图。这种方法还允许我们评估受试者和部位特异性的微生物模式，包括可能在宿主反应中起作用的分类学水平差异。

我们的论文重点关注四个主要目标：(1) 研究飞行前后的微生物动态；(2) 探查来自太空飞行/ISS环境的细菌引入；(3) 识别个别参与者特有的细菌；(4) 研究白细胞介素表达与微生物动态之间的关联。这些目标共同提供了对太空旅行对微生物动态影响的全面理解。一篇配套论文讨论了这两项任务的分子生物学和多组学结果。此外，这种综合性和多任务设计有助于识别个体化的微生物特征及其与免疫反应的潜在关联，进一步支持了这项研究的假设生成性质。

我们的发现有助于建立一个标准化框架，使用16S核糖体RNA基因（rRNA）扩增子测序来跟踪多个太空飞行时间点上的微生物相对丰度变化。还对部分生物样本进行了全基因组测序（WGS），以验证16S rRNA基因扩增子测序的结果。单细胞转录组学提供了关于太空飞行期间白细胞介素动态的补充信息。这些综合方法增强了我们对不同持续时间下太空飞行压力因素对免疫调节和微生物恢复力的理解。这里呈现的发现旨在提供描述性和假设生成性的信息，为未来更大规模的研究奠定基础。

结果
本研究收集了来自两次任务的样本，分别是Ax-2和Ax-3，共6名受试者（Ax-2 4名，Ax-3 2名）。微生物组研究涉及259个样本，单细胞研究包含17个样本，总计276个生物样本。用于微生物组研究的样本类型包括唾液、粪便、尿液以及从身体10个不同部位（前臂掌侧[ARM]、耳后[EAR]、臀沟[GLU]、枕部[NAP]、鼻腔[NAC]、口腔[ORC]、腋窝[PIT]、额部[TZO]、脐部[UMB]和趾蹼[WEB]）采集的体表拭子，每个时间点各采集四次。对于Ax-2任务，样本在发射前三个时间点（L-90、L-30和L-3）和返回后一个时间点（R+6）采集；L-30、L-3和R+6采集的样本用于16S rRNA基因扩增子测序。对于Ax-3任务，样本在发射前两个时间点（L-30和L-2）和返回后两个时间点（R+1和R+21）采集。从6名受试者（Ax-2 4名，Ax-3 2名）中，分别采集了155个和104个样本，共计259个生物样本（图1）用于16S rRNA基因扩增子测序。

图1 两次太空任务的生物样本收集和测序工作流程
(A) 分别来自Ax-2（10天）和Ax-3（21天）任务的生物样本收集示意图，涉及四名和两名参与者，包括在ISS上的停留时间。四种非血液样本类型（体表拭子、唾液、粪便和尿液）在多个时间点采集，包括飞行前（Ax-2和Ax-3各两次）和飞行后（Ax-2一次，Ax-3两次）。血液样本在多个时间点采集，包括飞行前（Ax-2两次，Ax-3一次）和飞行后（Ax-2一次，Ax-3两次）。从6名个体采集的259个生物样本中提取DNA；对16S rRNA基因的V4区域进行了测序。根据样本类型和微生物多样性及丰度对数据进行了稀释处理。从18个血液来源的生物样本中分离出PBMCs，其中17个成功进行了单细胞RNA测序和下游转录组分析。
(B) 圆形图显示了按任务（Ax-2用蓝色表示，Ax-3用橙色表示）、样本类型及其数量以及采集时间点（L = 飞行前，R = 飞行后）划分的样本分布，从中生成了16S rRNA基因扩增子和scRNA序列数据。这形成了一个多时间点和重叠采样的设计。Ax-2和Ax-3任务分别在ISS上停留了10天和21天（图1）。这种纵向和多部位采样策略为评估早期微生物组及其与飞行后白细胞介素的关联提供了独特的研究设计。

对于Ax-2队列，处理的155个样本中，有一个样本在初始质量控制步骤中失败并被排除在测序之外。此外，12个样本（一个唾液样本和11个体表拭子样本）生成的映射读数不足，未能通过质量控制。剩余的142个样本成功生成了测序数据，成功率为91.61%。对于Ax-3队列，处理的104个样本中，有一个（尿液样本）生成的映射读数不足，未能通过质量控制。剩余的103个样本成功生成了测序数据，成功率为99%。选择16S rRNA基因扩增子测序而非全基因组测序（WGS），因为它成本较低，所需DNA输入量少，并且有标准化的分析流程。数据还产生了与WGS类似的分类学特征，使得跨研究比较更容易进行，无论是低生物量还是高生物量的样本。表1总结了Ax-2和Ax-3任务的每个样本类型的平均、最小和最大测序读数及其稀释截止值，同时还显示了使用的稀释值和标准差（SD）。鉴于收集样本的多样性和生物量，分析前使用了不同的稀释值以减少由于测序深度不同而导致的结果差异。Ax-2任务的唾液、粪便、尿液和体表拭子样本的稀释倍数分别为61,820；305；5,930；192读数，Ax-3任务的稀释倍数分别为22,056；33,799；1,134；6,131读数（表1）。为了最小化Ax-2和Ax-3任务数据集之间由于测序深度不同而产生的结果差异，体表拭子样本也按样本类型进行了稀释（表1）。Ax-2任务中的1份唾液样本和11份身体拭子样本，以及Ax-3任务中的1份尿液样本，由于读取次数不足而被排除在分析之外。

| 样本名称 | 样本类型 | 读取次数 | 范围 | 最小值 | 最大值 |
| ------- | -------- | --------- | -------- | -------- |
| Axiom 2 | 唾液 | 7,871 | 1.91 ± 10.28 | 5.230 |
| | | 31,847 | 7–41 |
| | 粪便 | 74,421 | 1.3 ± 9.10 | 9.861 |
| | | 87,796 | 4–151 |
| | 尿液 | 62,691 | 1.2 ± 5.00 | 6.353 |
| | | 145,071 | 12–76 |
| 身体拭子 | 腋窝（PIT） | 1,615 | 5.83 ± 1.68 | 4.734 |
| | | 31,714 | 7–32 |
| | 下唇（TZO） | 16,416 | 6.3 ± 16.06 | 8.919 |
| | | 37,114 | 4–33 |
| | 臀沟（GLU） | 34,052 | 2.5 ± 35.58 | 9.733 |
| | | 59,585 | 12–32 |
| | 鼻孔（NAC） | 28,505 | 5.8 ± 30.21 | 4.323 |
| | | 79,378 | 3–71 |
| | 枕骨（NAP） | 3,130 | 0.5 ± 2.97 | 0.643 |
| | | 10,174 | 2–88 |
| | 口腔（ORC） | 70,540 | 8.8 ± 23.28 | 7.620 |
| | | 105,121 | 4–113 |
| | 耳后（EAR） | 10,150 | 6.3 ± 11.37 | 0.626 |
| | | 27,738 | 1–11 |
| | 脚趾间（WEB） | 54,667 | 4.1 ± 18.66 | 1.247 |
| | | 113,108 | 4–70 |

表1 显示了经过16S rRNA基因扩增子测序后，唾液、粪便、尿液和身体拭子样本的平均读取次数、最小值、最大值、标准差以及稀释度切点。同时列出了Ax-2和Ax-3任务中每种样本类型的微生物属的最小和最大数量。稀释度是按样本类型单独进行的，以减少不同稀释度切点对多样性和分类学特征的影响。

为了评估alpha多样性或样本内的微生物多样性，计算了六名受试者（Ax-2任务四名，Ax-3任务两名）的粪便、唾液、尿液和身体拭子样本的观察到的操作分类单元（OTUs）数量和Shannon多样性指数（图2A和2B）。观察到的OTUs是物种丰富度的度量，而Shannon指数结合了丰富度和均匀度。通过非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验来评估两组或三组及以上组的alpha多样性差异，p值使用了FDR校正进行调整。每个任务的箱线图按时间点着色：Ax-2的L-30、L-3和R+6；Ax-3的L-30、L-2、R+1和R+21（图2A和2B；图S1和S2）。这些可视化图表显示了身体各部位在时间上的丰富度和均匀度变化趋势。

**表1 样本统计**

**图2 微生物组（粪便、唾液、尿液和身体拭子样本）的alpha多样性分析**
(A) 和 (B) 展示了Ax-2（A）和Ax-3（B）参与者的观察到的操作分类单元（OTUs）数量以及基于样本类型稀释后的粪便、唾液、尿液和身体拭子样本的Shannon多样性指数。箱线图描绘了人类微生物组中OTUs数量和Shannon多样性的变化。箱线图按时间点着色，分别为Ax-2任务的L-30、L-3和R+6，以及Ax-3任务的L-30、L-2、R+1和R+21。Ax-2任务共包括12份粪便样本、11份唾液样本、12份尿液样本和120份身体拭子样本；Ax-3任务共包括8份粪便样本、8份唾液样本、8份尿液样本和80份身体拭子样本。通过非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验来评估两组或三组及以上组的差异，p值使用了FDR校正。调整后的p值显示在图中。

总体而言，Ax-2（观察到的OTUs adj. p = 0.84；Shannon多样性 adj. p = 0.87）和Ax-3（两个指标的adj. p = 0.76）任务的粪便alpha多样性保持高度稳定。唾液在飞行后的alpha多样性有轻微但不显著的下降（Ax-2的观察到的OTUs adj. p = 0.91；Shannon adj. p = 0.93；Ax-3的观察到的OTUs adj. p = 0.92；Shannon adj. p = 0.64）。与粪便相比，尿液的丰富度较低，且在Ax-2（观察到的OTUs adj. p = 0.69；Shannon = 0.94）和Ax-3（观察到的OTUs adj. p = 0.94；Shannon adj. p = 0.71）中变化很小（图2A和2B）。

**图3 Beta多样性分析**

通过Bray-Curtis距离进行beta多样性分析，并通过主坐标分析（PCoA）图进行可视化。通过 permutation multivariate analysis of variance (PERMANOVA) 来评估显著性。结果在Ax-2（图3A）和Ax-3（图3B）任务的PCoA图中显示了样本之间的显著微生物群落差异。这些模式基于PERMANOVA检验。

**图4 多维分析**

(A) 和 (B) 展示了Ax-2（A）和Ax-3（B）任务的粪便、唾液和尿液样本的Bray-Curtis距离的PCoA图。p值使用PERMANOVA计算，并在图中与R平方值一起显示。

在两个任务和受试者中，样本按样本类型而非时间点强烈聚集，表明身体部位身份是微生物组成的主要驱动因素。唾液、粪便或尿液没有明显的时间分离，表明这些生态位在太空飞行条件下保持稳定。PERMANOVA结果证实了这一模式：Ax-2受试者的p值范围为0.793至0.93，R2值范围为0.0416至0.137；Ax-3受试者的p值范围为0.979至0.991，R2值范围为0.0631至0.0645，表明时间点解释的变异很小。

在身体拭子中，Ax-2任务期间收集的NAC（p = 0.015；R2 = 0.394）和ARM（p = 0.022；R2 = 0.276）样本显示出飞行前后特定的差异，支持皮肤相关微生物群的局部变化（图S3）。相比之下，Ax-3在任何部位都没有显示出统计学上的显著变化，尽管按受试者进行的视觉聚类显示出强烈的个体特征（图S4）。

为了进一步评估独立于身体部位聚类的时间微生物动态，生成了额外的PCoA分析，并将生物样本类型作为独立的面显示（图S5）。这种方法可以单独可视化唾液、粪便、尿液和皮肤相关微生物组的纵向微生物变化，从而减少了联合分析中由解剖部位差异引起的主导分离。面状排序显示，每个样本类别内的微生物群落结构在时间上保持相对稳定。

通过对六个受试者（Ax-2任务四名，Ax-3任务两名）的相对丰度进行估计，作为每个样本中分配给每个分类单元的读取比例，用于分类学分析。分类学分析揭示了所有样本类型中的受试者特异性和任务依赖性模式（图4A–4D）。例如，Ax-2任务的唾液样本主要由葡萄球菌属主导，丰度范围为8.52%至86.23%，其次是棒状杆菌属，丰度范围为2.95%至69.18%。特定受试者的相对丰度表现出特定模式。例如，受试者SO5Ql3Kg6H的唾液样本从葡萄球菌属（L-30时的86.23%）转变为细胞莫拉菌属（R+6时的22.95%）。相比之下，Ax-3任务的唾液样本主要由链球菌属（8.12%–21.77%）、奈瑟菌属（10.41%–14.34%）、嗜血杆菌属（2.64%–21.94%）和普雷沃氏菌属（5.18%–19.41%）主导。

**图5 多样性分析**

(A) 和 (B) 显示了Ax-2（A）和Ax-3（B）任务的唾液、粪便和尿液样本的气泡图，展示了各生物样本类型中前十常见的细菌属的相对丰度。(C) 和 (D) 展示了从10个解剖部位（ARM、EAR、GLU、NAP、NAC、ORC、PIT、TZO、UMB和WEB）收集的Ax-2（C）和Ax-3（D）身体拭子样本。x轴代表时间点（Ax-2：L-30、L-3、R+6；Ax-3：L-30、L-2、R+1和R+21），左侧y轴列出细菌属。气泡大小对应百分比丰度（0.00–1.00），右侧y轴区分样本类型（A和B）。这些可视化图表能够直接比较不同时间点、样本类型和受试者之间的微生物群落特征，突出显示了部位特异性和任务依赖性的微生物组组成模式。

粪便微生物组在两个任务中都表现出受试者特异性的时间变化，而总体上仍由常见的肠道相关细菌属主导。例如，Ax-2收集的粪便样本显示出拟杆菌属、普雷沃氏菌科和粪杆菌属的相对丰度较高。尿液微生物组也显示出潜在的任务和受试者特异性模式。例如，在Ax-2中，两名受试者的尿液微生物组主要由乳酸杆菌属主导，而在另外两名受试者中，葡萄球菌属和棒状杆菌属是主要细菌。相比之下，Ax-3的尿液样本主要由鞘毛菌属主导，飞行后链球菌属出现短暂增加（观察到的OTUs adj p = 0.0065），而均匀度没有相应变化（Shannon adj p = 0.28）。Ax-3的尿液样本在飞行后表现出丰富的物种多样性（观察到的OTUs adj p = 0.0065），尽管如此均匀度基本保持稳定（Shannon adj p = 0.28）。

对于Ax-2任务的唾液样本，飞行后观察到的OTUs数量减少了70%（adj. p = 0.84；Shannon多样性 adj. p = 0.87），而Ax-3任务的唾液样本飞行后观察到的OTUs数量减少了60%（adj. p = 0.91；Shannon adj. p = 0.93）。尿液显示出较低的丰富度，与粪便相比变化很小（Ax-2的观察到的OTUs adj. p = 0.69；Shannon = 0.94；Ax-3的观察到的OTUs adj. p = 0.94；Shannon adj. p = 0.71）。

**Taxonomic analyses**

通过对六名受试者（Ax-2任务四名，Ax-3任务两名）的相对丰度进行估计，作为分配给每个样本中每个分类单元的读取比例，用于分类学分析。分类学分析揭示了所有样本类型中的受试者特异性和任务依赖性模式（图4A–4D）。例如，Ax-2任务的唾液样本主要由葡萄球菌属主导，丰度范围为8.52%至86.23%，其次是棒状杆菌属，丰度范围为2.95%至69.18%。特定受试者的相对丰度表现出特定模式。例如，受试者SO5Ql3Kg6H的唾液样本从葡萄球菌属（L-30时的86.23%）转变为细胞莫拉菌属（R+6时的22.95%）。相比之下，Ax-3任务的唾液样本在不同时间点主要由链球菌属（8.12%–21.77%）、奈瑟菌属（10.41%–14.34%）、嗜血杆菌属（2.64%–21.94%）和普雷沃氏菌属（5.18%–19.41%）主导。

**图6 任务和样本类型的top 10最常见细菌属的多维分析**

(A) 和 (B) 显示了Ax-2（A）和Ax-3（B）任务的唾液、粪便和尿液样本的泡泡图，展示了各生物样本类型中前十常见细菌属的相对丰度。(C) 和 (D) 展示了从10个解剖部位（ARM、EAR、GLU、NAP、NAC、ORC、PIT、TZO、UMB和WEB）收集的Ax-2（C）和Ax-3（D）身体拭子样本。x轴代表时间点（Ax-2：L-30、L-3、R+6；Ax-3：L-30、L-2、R+1和R+21），左侧y轴列出细菌属。气泡大小对应百分比丰度（0.00–1.00），右侧y轴区分样本类型（A和B）。这些可视化图表能够直接比较不同时间点、样本类型和受试者之间的微生物群落特征，突出显示部位特异性和任务依赖性的微生物组组成模式。

粪便微生物组在两个任务中都表现出受试者特异性的时间变化，而总体上仍由常见的肠道相关细菌属主导。例如，Ax-2收集的粪便样本显示出拟杆菌属、普雷沃氏菌科和粪杆菌属的相对丰度较高。尿液微生物组也显示出潜在的任务和受试者特异性模式。例如，在Ax-2中，两名受试者的尿液微生物组主要由乳酸杆菌属主导，而在另外两名受试者中，葡萄球菌属和棒状杆菌属是主要细菌。相比之下，Ax-3的尿液样本主要由鞘毛菌属主导，飞行后链球菌属出现短暂增加，偶尔出现链球菌属。

**Figure S2**显示，在Ax-2任务期间，R+6时间点收集的枕骨（NAP）样本的alpha多样性显著增加（观察到的OTUs adj. p = 0.024；Shannon adj. p = 0.05）。在Ax-2任务期间，口腔（ORC）样本的Shannon多样性也出现显著变化（adj. p = 0.024）（图S1）。在Ax-3中，飞行后观察到丰富的物种多样性增加（观察到的OTUs adj. p = 0.0065），但均匀度没有相应变化（Shannon adj. p = 0.28）。Ax-2任务的NAP和ORC对空间飞行敏感，Ax-3任务的TZO对空间飞行敏感（观察到的OTUs adj. p = 0.11；Shannon adj. p = 0.13）。Ax-3任务的NAC和PIT没有观察到显著的变化（观察到的OTUs adj. p = 0.11；Shannon adj. p = 0.13）。Ax-3任务的身体拭子在飞行后没有显示出显著的alpha多样性变化（图S2）。

**Additional notes**

我们注意到在Ax-3任务中，从太空飞行/国际空间站（ISS）环境中可能出现细菌的罕见出现。具体来说，在Ax-3任务中，受试者SO4Fh9Mk9N的身体拭子在R+1时间点的ARM样本中检测到寡养菌属（0.52%），而在所有其他参与者的飞行前和飞行后的生物样本中均未发现。这表明可能是从ISS中出现的细菌，鉴于他们在ISS停留了多天。我们通过WGS宏基因组测序进行了进一步验证，确认在飞行前的生物样本中有一个读长映射到寡养菌属，而在R+1的生物样本中检测到2,904个读长（表S2）。全基因组测序(WGS)数据的菌株水平分析表明，来自同一受试者(SO4Fh9Mk9N)的尿路寡杆菌(Oligella urethralis)和尿素分解寡杆菌(O. ureolytica)在L-2阶段的数据量为0和1；在R+1阶段分别为1,856和831，进一步支持了这些细菌可能在太空飞行/国际空间站(ISS)环境中出现的观点。

我们的研究揭示了潜在细菌分类群的明显模式，这些模式在不同受试者和样本类型之间似乎存在差异，表明太空飞行具有个性化的微生物特征。唾液样本中仅受试者SO2Dc7Ny8V检出厌氧球杆菌(Anaeroglobus)。粪便样本进一步突显了微生物谱的个体差异，其中SO2Dc7Ny8V含有厌氧普雷沃氏菌(Anaeroplasma)、脱硫弧菌(Desulfovibrio)和霍尔德曼菌(Holdemanella)，而SO4Fh9Mk9N则独特地携带了普雷沃氏菌_7(Prevotella_7)、里肯氏菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)和颗粒菌(Granulicatella)。身体拭子样本中仅在SO2Dc7Ny8V中检出霍尔德曼菌，在L-30时TZO和NAP中检出0.02%，在L+1和R+21时检出0.25%。

在Ax-2研究中，我们纳入了11个血液样本进行单细胞数据分析(图1)。对Ax-2中L-30、L-3、R+1时间点的白细胞介素(IL-32和IL-16)表达水平进行群体分析(图5A)发现，飞行后时间段(R+1)这两种免疫因子的转录水平升高，表明太空飞行后免疫反应增强。

我们分析了Ax-2和Ax-3两个宇航员组在L-30、L-3、R+1时间点的白细胞介素表达情况。结果显示，飞行后IL-32和IL-16的表达水平显著上升，支持太空飞行后免疫系统激活的观点。IL-32在所有受试者中均表现出升高趋势，而IL-16在三名受试者(SO6Nj3Uf7T、SO8Kf3Ez1C、SO9Wb8Cn8A)的飞行后表达量增加。这些细胞因子参与调节炎症反应和上皮屏障功能。

在Ax-3研究中，我们同样分析了6个血液样本。IL-16和IL-32的表达在飞行后时间点升高，而IL-15的表达在飞行后降低。这些变化表明太空飞行后立即引发了免疫系统的激活。受试者级别的分析进一步证实了这一趋势。

为了更好地理解IL-16和IL-32的作用，我们对四名宇航员的微生物组和细胞因子转录表达进行了相关性分析，整合了Axiom-2的微生物谱与多种样本类型中的细胞因子转录反应。共发现了14个显著相关性，涉及分布在五种样本类型(鼻部(NAC)、颈部(NAP)、口腔(ORC)、粪便和尿液)中的13个独特细菌分类群。正相关关系主要出现在口腔样本中(表S3)，表明口腔及肠道和鼻腔微生物与细胞因子表达之间存在较强关联。这些正相关性(皮尔逊相关系数r > 0.95，斯皮尔曼相关系数一致性良好)揭示了特定微生物分类群与IL-16或IL-32之间的相互作用。

总体而言，这些发现表明黏膜部位(口腔和鼻腔)和肠道微生物组可能成为可测量免疫-微生物组关联的场所，IL-16和IL-32在多种分类群和样本类型中表现出一致的正相关。Ax-3组的分析未进行相关性分析。细胞因子激活与微生物获取的时间一致性支持了太空飞行导致免疫信号和微生物组组成协调变化的假设，强调了在长期任务期间监测宿主-微生物相互作用的重要性。

Ax-2(10天)和Ax-3(21天)任务提供了研究不同持续时间商业太空飞行期间微生物组动态的独特机会。通过对6名宇航员的259份生物样本的分析，本研究观察到唾液、粪便、尿液和身体拭子中的微生物群有保守 yet 个体化的变化，表明太空飞行对其产生了选择压力。值得注意的是，粪便和唾液的微生物组保持高度稳定，这与地球上的肠道和口腔微生物群稳定性的证据一致。这项研究是首批整合多个商业ISS任务中的多部位微生物组分析并与免疫转录组数据结合的研究之一，从而更全面地评估了宇航员对太空飞行的早期微生物组反应。与专注于太空飞行栖息地内环境微生物组的研究不同，本研究特别关注了宇航员多个身体部位的纵向微生物组动态，提供了人类对太空飞行独特反应的补充见解。

我们的研究首次关注了太空飞行最初三周内的微生物组动态，扩展了NASA twins研究和3天Inspiration4任务的先前研究成果。虽然长期任务报告了微生物组组成的变化，但像Inspiration4这样的短期任务仅观察到短暂的皮肤微生物组变化，而没有明显的肠道或口腔变化。Voorhies等人研究了在ISS长期停留期间肠道微生物组的变化，但本研究检查了十个解剖部位和多种样本类型的六名宇航员。我们的结果揭示了皮肤相关分类群的持续变化，而肠道和口腔微生物组基本稳定，表明皮肤微生态对太空飞行条件特别敏感。beta多样性分析表明，个体身份和身体部位是微生物群结构的主要影响因素，而太空飞行相关的时间效应仅占观察到的变异的一小部分。这些发现表明，宇航员的微生物组在整个研究期间基本保持个体化且具有部位特异性，微生物群的长期变化发生在相对稳定的基线社区结构背景下。

无论是在Ax-2还是Ax-3任务中，我们都观察到黏膜部位(口腔和鼻腔)和肠道微生物组的最大变异。这与先前的证据一致，表明这些部位对环境压力(如湿度、卫生条件和限制环境)非常敏感。肠道和口腔微生物群的稳定性表明，皮肤微生态在太空飞行条件下特别脆弱。此外，ISS的封闭和共享环境以及宇航员之间的密切互动可能促进了微生物交换，导致了个体和部位间微生物组的差异。肠道微生物组在太空飞行条件下表现出较强的韧性，主要由Bacteroides和普雷沃氏菌等核心分类群主导。肠道微生物组的相对丰度模式表明个体代谢适应，而非均匀变化。陆地研究表明，尽管存在环境压力，肠道微生物群仍能保持功能稳定性。尿路微生物组的多样性较低，时间变化也很小。Ax-2中两名受试者的样本以乳酸杆菌为主，而Ax-3中乳酸杆菌的比例较高，这可能与女性受试者有关。

皮肤微生物组对太空飞行条件的敏感性最高，这与先前研究一致，表明这些社区对环境压力(如湿度和卫生条件)非常敏感。这些陆地研究还显示，皮肤微生物组会对环境压力做出反应，如Lawsonella和Sphingomonas等机会性菌株在微重力下出现。尽管肠道和口腔微生物群保持稳定，但皮肤微生态的短暂变化可能预示了微生物扰动，需要在长期任务中加以关注。ISS的封闭环境和宇航员之间的密切互动可能促进了微生物交换，导致了个体间和部位间的微生物组差异。这些革兰氏阴性、非发酵性的球杆菌主要与人泌尿生殖道相关，通常被认为是低毒性的微生物，尽管也有机会性感染的报道。由于寡螺菌属（Oligella）不常被报道为环境污染物，且主要与宿主相关，因此在飞行后的皮肤样本中检测到它们是一个不寻常的现象。这可能反映了短暂的定植、从宿主相关储存库的重新分布，或在如国际空间站（ISS）这样的封闭环境中暴露所致。这些发现得到了全基因组测序（WGS）的支持，表明微生物的引入是有限的、个体化的且数量较少，而不是在所有受试者中广泛存在。我们的研究发现了不同样本类型中的特定于受试者的细菌分类群，显示出太空飞行期间可能存在个性化的微生物特征。独特的分类群包括唾液中的厌气球杆菌（Anaeroglobus）、放线菌（Anaeroplasma）、脱硫弧菌（Desulfovibrio）和霍尔德曼菌（Holdemanella），以及多个皮肤部位的霍尔德曼菌，进一步强化了微生物组特征的个体差异。飞行后Ax-2和Ax-3模型中IL-32和IL-16转录本表达的增加表明了短暂的免疫激活。相关性分析进一步表明，这些细胞因子与多种微生物分类群的改变有关，提示它们可能在观察到的宿主-微生物组相互作用模式中起作用。然而，这些关联仅是相关的，需要进一步的研究来确定细胞因子变化与微生物群变化之间是否存在直接的机制关系。IL-32是一种多功能促炎细胞因子，可促进先天性和适应性免疫反应，有助于上皮屏障的调节，并在生理压力条件下参与宿主防御信号的传递。IL-16作为一种免疫趋化剂，调节T细胞的激活、招募和炎症信号传导，充当免疫监视和组织稳态的介质。观察到这两种细胞因子的转录本在两次独立飞行任务中均有所增加，支持了本研究中识别的免疫特征的生物学有效性，因为它们的已知作用与微重力、封闭环境、微生物暴露变化以及再入大气层时的生理压力所引起的免疫紊乱一致。尽管从现有数据集无法推断因果关系，但两次任务中观察到的可重复性增加加强了这样的解释：测量到的分子反应反映了具有生物学意义的生理适应，而不是技术变异。对IL-32和IL-16等细胞因子的纵向监测可以通过识别在飞行后出现免疫激活增强或恢复延迟的宇航员来改善对宇航员健康的监控。在飞行中采样在物流上具有挑战性，且往往不完整，这导致了我们对微生物组变化何时以及如何发生了解的不足。为解决这一问题，我们建议在返回前使用干体拭子进行采样，并在溅落后立即添加拭子采集缓冲液以保存样本。这种方法可以减轻微重力环境下打开含液体试管的挑战，并使未来的采样更加安全、实用。

总之，这项研究全面描述了短期商业太空飞行任务期间的微生物组动态和免疫反应，揭示了关于微生物适应性和部位特异性模式的新见解。通过整合微生物组测序和细胞因子转录本分析，该研究表明太空飞行会诱导与皮肤相关的微生物组和免疫信号的协调变化，而核心肠道和口腔微生物群则基本保持稳定。本研究还发现了一次飞行后环境微生物从太空飞行/ISS中出现的实例，突显了太空中宿主-微生物相互作用的复杂性。这项工作为多个商业太空飞行任务的微生物组监测和免疫监视建立了一个标准化框架，以确保宇航员在前往月球、火星及更远地方的任务中的安全。总体而言，这项研究为太空生物学领域做出了几项新的贡献：首先，通过在唾液、粪便、尿液和皮肤相关部位进行多部位采样，突出了强烈的个体和部位特异性微生物特征；其次，在飞行后样本中检测到低丰度分类群，表明可能存在环境或ISS相关的微生物出现，强调了封闭栖息地中微生物交换的复杂性；第三，将微生物组分析与单细胞免疫数据相结合，能够在转录本水平上将微生物动态与IL-32和IL-16等细胞因子的升高联系起来。最后，这项工作为跨任务和样本类型的微生物组纵向监测建立了一个实用框架，可以扩展到未来的商业和长期太空飞行研究中。

**研究的局限性**
队列规模仅限于两次独立任务中的六名宇航员。尽管纵向采样在多个身体部位和时间点生成了大量生物样本，但参与者的数量较少，限制了统计功效和对更广泛宇航员群体的普遍适用性。不同任务之间的差异应谨慎解释。由于队列分布不均、任务持续时间、环境暴露、饮食、生理因素、性别特定因素、操作条件以及未记录的卫生习惯的差异，难以区分特定于任务的效果和个体间变异性。因此，观察到的微生物丰度差异被认为是探索性的和假设生成的，而不是持续时间相关效应的确定证据。此外，16S rRNA基因扩增子测序提供的仅为属级别的分辨率，rRNA基因拷贝数的变化可能会影响相对丰度估计。未来结合全宏基因组学、宏转录组学和更大规模多组学的研究将有助于更好地定义太空飞行期间的微生物功能适应性和宿主相互作用。尽管在转录本水平上的细胞因子分析提供了补充的宿主反应背景，但观察设计排除了对微生物组-免疫相互作用进行因果推断的可能性。这些分析并未设计或具备建立机制关系的能力，因此应对微生物和免疫变化之间的关联持谨慎态度。

**资源可用性**
- **数据和技术可用性**
- 微生物组和单细胞序列的已测序数据已上传至TRISH EXPAND TrialX数据库中的相应微生物组和单细胞数据目录，用于Axiom 2和Axiom 3任务。数据请求可以通过TRISH EXPAND数据库门户发起。数据访问受EXPAND数据库隐私和发布委员会（DPRB）的管理。用于生成本文图形的源数据可从GitHub获取（https://github.com/qiaoyanw/Olink-Explore-HT-Analysis-Methods-for-TRISH_AX2_AX3-Flight/tree/main）。
- 本研究未生成任何新的独特试剂或材料。

**致谢**
我们感谢Nathanael Emerick在相关分析中的宝贵帮助。本研究由NASA合作协议NNX16AO69A下的Translational Research Institute for Space Health资助（Grant# INN0010）。单细胞文库由贝勒医学院的单细胞基因组学核心团队制备，该团队得到了CPRIT RP200504和P30CA125123的资助。作者感谢人类基因组测序中心的研究参与者和生产团队在数据生成方面的支持。

**作者贡献**
- 构思：H.D.、R.A.G.和A.K.
- 数据整理：T.M.S.-R.、M.C.R.、A.K.、X.Q.、S.B.、K.K.、A.S.、M.M.M.、Y.C.、M.-C.G.、Z.M.和D.B.
- 形式分析：A.K.、T.M.S.-R.、X.Q.、A.S.、K.W.和Q.W.
-撰写-初稿：H.D.和A.K.
-撰写-审阅和编辑：A.K.、T.M.S.-R.、Z.M.、A.S.、S.B.、K.K.、K.W.、E.U.、S.M.G.、M.M.M.、J.W.、D.M.、R.A.G.和H.D.

**利益声明**
作者声明没有利益冲突。

**方法**
- **关键资源表**

**试剂或资源**
- **生物样本**
- Ax-2任务船员的唾液、粪便、尿液、身体拭子和血液样本：从同意参与的受试者处新鲜获得
- Ax-3任务两名受试者的唾液、粪便、尿液、身体拭子和血液样本：从同意参与的受试者处新鲜获得

- **化学品、肽和重组蛋白**
- KAPA Library Quant Complete试剂盒（ABI Prism?）（目录号07960204001）
- 无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号AM9937）
- 绝对乙醇（200 Proof）（Avantor，目录号89125–170P1.1，5′-AATGATACGGCGACCACCGAGA）（Sigma，定制）
- Illumina Truseq DNA Ud指数（96个索引，96个样本）（Idt，目录号20022370）
- Kapa Hyper prep试剂盒（96个样本，Kapa，目录号KK8504）
- NGS片段试剂盒（1-6000bp）（Agilent，目录号DNF-473–1000）
- OmniGene.GUT DNA和RNA（RUO）（DNAgenotek，目录号OMR-205）
- Thermo Scientific SAMCO Wide-Mouth Bio-Tite（100个样本容器，用于尿液收集）（Samco，目录号13–711–65）
- Zymo Research尿液处理缓冲液（140.0 mL，添加1 mL胆盐至70 μL UC缓冲液）（Zymo Research，目录号D3061-1-140）
- Isohelix DNA/RNA口腔拭子（MS Mini，单独包装并经过环氧乙烷处理，用于微生物组采样）（Isohelix/Fisher，目录号MS-02）
- Qiagen DNeasy PowerSoil Pro试剂盒（Zymo Research，目录号27500-4-EP）

**数据访问代码**
- Ax-2任务的访问代码/唯一数据集标识符未分配
- Ax-3任务的访问代码/唯一数据集标识符未分配

**寡核苷酸**
- 515F-AATGATACGGCGACCACGGAGATCTACACGCTTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA（IDT：https://www.idtdna.com/806）
- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCCTTGTCTCCAGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAATIDT（IDT：https://www.idtdna.com/Picogreen assay）
- Platinum Taq（Invitrogen，目录号5966005）

**软件和算法**
- ProSize数据分析软件（Agilent，https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/fragment-analyzer-systems/fragment-analyzer-systems-software/fragment-analyzer-software-1149185）
- QuantStudio实时PCR软件（Thermo Fisher Scientific，https://www.thermofisher.com/us/en/home/global/forms/life-science/quantstudio-6-7-flex-software.html?erpType=Global_E1bcl2fastq）
- BBMap（v38.82）（BBMap，https://sourceforge.net/projects/bbmap/bbduk）
- BBMap（https://bbmap.org/tools/bbmerge）
- Uparse（GitHub，https://drive5.com/uparse/MAFFT）
- MaFFT（Mafft.cbrc.jp，https://alignment/software/FastTree）
- Silva数据库（v.138.1）（Silva，https://www.arb-silva.de/Rstudio）
- R Studio（https://posit.co/download/rstudio-desktop/ATIMA）
- BBMap版本39.01（用于质量和接头修剪、宿主读取去除）（GitHub，https://github.com/BioInfoTools/BBMap）
- MetaPhlAn版本4.2.4（用于WGS序列分类，https://github.com/biobakery/MetaPhlAn）
- Kraken2版本2.1.6（用于差异丰度分析，https://github.com/DerrickWood/kraken2）
- MaAsLin3（用于10X基因组学细胞 Ranger v7.2.0）
- Chromium Single Cell Immune Profiling Solution 5′ v2（GEX & VDJ，https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/7.2）
- Chromium Single Cell Immune Profiling Solution 5′ v3（GEX & VDJ，https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/8.0）
- 10X基因组学参考版本GRCh38 GEX 2020-A（2020年7月7日，GENCODE v32/Ensembl 98）（用于GEX数据集的人类参考，https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest/release-notes/cr-reference-release-notes）

**实验模型和研究参与者详情**
- **人类研究参与者**
- Ax-2任务的参与者（n=4）年龄范围为31至67岁（2名男性和2名女性）。Ax-3任务的生物样本来自4名机组成员中的2名（n=2）；为保护参与者隐私，未报告额外的人口统计细节。
- **IRB关于人类受试者的声明**
- 协议名称：EXPAND-MESH（增强探索平台和模拟定义-多模态评估太空飞行参与者健康（H-52035）。本研究中使用的人类生物样本是根据贝勒医学院机构审查委员会批准的协议（协议编号H-52035）获得的。所有参与者都提供了书面同意，允许收集和研究使用他们的样本。样本在分析前进行了去标识化，所有研究活动均符合机构指南和适用法规。

**方法细节**
- **生物样本收集和处理**
- 本研究收集了来自两次任务（共6名宇航员）的多种生物样本，包括四种类型：唾液、粪便、尿液和身体拭子。从Ax-2任务的4名受试者和Ax-3任务的2名受试者中收集了低生物量（身体拭子、唾液和尿液）和高生物量（粪便）样本（图1A）。身体拭子样本从10个不同部位收集，包括耳后（EAR）、腋窝（PIT）、前臂掌侧（ARM）、枕部（NAP）、脐部（UMB）、臀沟（GLU）、眉间（TZO）、趾间（WEB）和鼻拭子（NAC）（图1A）。Ax-2任务的样本在发射前30天（L-30）和3天（L-3）以及返回后6天（R+6）收集。Ax-3任务的样本在发射前30天（L-30）和2天（L-2）以及返回后1天（R+1）和21天（R+21）收集。从Ax-2任务的4名参与者中共收集了11份唾液、12份粪便、12份尿液和120份身体拭子样本；从Ax-3任务的2名参与者中收集了8份唾液、8份粪便、8份尿液和80份身体拭子样本，然后对这些样本进行了16S rRNA基因（V4区域）扩增子测序。其中一名参与者在返回ISS后无法提供唾液样本（表S1）。

- **DNA提取和16S rRNA基因V4区域扩增**
- 使用Qiagen DNeasy PowerSoil Pro试剂盒根据制造商说明提取了来自Ax-2的155份和Ax-3的104份样本的DNA和16S rRNA基因V4区域。Ax-2的一个样本在质量控制步骤失败并被排除，因此共有258份样本用于测序。使用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增了16S rRNA基因V4区域。用于扩增的引物包含适用于MiSeq测序的接头序列，以及整合到反向引物中的单索引条形码，从而产生的PCR产物可以直接合并并进行测序，每个样本的平均读长约为25,000对。随后这些产物在Illumina MiSeq平台（2 x 250 bp）上进行测序。

数据注释：
原始数据文件以二进制碱基调用格式转换为FASTQ格式，并使用Illumina的‘bcl2fastq’软件根据单索引条形码进行解复用。解复用的读长首先通过bbduk.sh（BBMap，版本38.82）进行初步质量过滤，去除Illumina接头序列、PhiX序列以及Phred质量分数<15且长度<100 bp的读长。经过质量控制后的读长使用bbmerge.sh合并，合并参数为：maxstrict = t, qtrim = t, trimq = 15。合并后的读长进一步通过vsearch进行过滤，过滤参数针对16S rRNA基因的V4区域进行了优化。所有读长最终合并成一个FASTA文件，以便进一步使用UPARSE处理。通过UPARSE算法以97%的相似性阈值对读长进行OTU聚类，该算法包含嵌合体过滤步骤。简要来说，首先使用vsearch的‘derep_fulllength’选项去除重复读长，记录大小以识别单一基因型。去除重复读长后的非单一基因型通过usearch70的‘cluster_otus’函数以0.4%的增量进行迭代聚类。单一基因型使用usearch70的‘-usearch_global’9以99%的同一性映射到去除重复读长的序列中，并将映射后的读长添加到输出文件中。最终输出结果使用usearch70的‘uchime_ref’与GOLD数据库v510.11进行比对，仅使用正链，并排除嵌合体。然后将OTU质心映射到最新的优化版本的SILVA数据库中，该数据库仅包含16S rRNA基因V4区域的序列，以便使用usearch70的‘usearch_global’函数确定分类群，指定同一性阈值为97%。通过将解复用的读长映射到OTU文件中来恢复丰度，创建一个Biom格式的OTU表格，并去除嵌合体读长。microbiome文件中的系统发育信息是通过将质心序列与mafft对齐并使用FastTree生成树状图来获得的。

数据分析：
在分析之前，对每个样本类型进行了稀释处理，以减少不同稀释阈值对多样性和分类群特征的影响。样本稀释后，按照以下方法进行了多样性和分类群分析。从每个样本类型的相对丰度分布中生成分类群丰度可视化图，突出显示在纵向样本中始终检测到的最丰富和最一致的属，以表征主导的微生物模式。由于队列规模较小，没有应用正式的流行率过滤、差异丰度测试或预定义的选择标准。相对丰度估计是基于标准工作流程从标准化的16S rRNA基因扩增子测序数据中得出的。

由于粪便、唾液、尿液和皮肤相关生物样本在微生物生物量和测序产率上存在显著差异，因此应用了针对样本类型的特定稀释阈值，以最大限度地保留纵向样本，同时尽量减少低生物量样本的排除。因此，多样性分析主要在生物样本类别内进行解释，跨样本类型或跨任务的定量比较应谨慎进行。此外，所有参与者和任务都一致地应用了标准化的生物样本采集、处理、储存和运输方案，以最小化技术变异性，并支持观察到的微生物组模式的可重复性，特别是对于皮肤相关样本。

多样性分析：
使用ATIMA（https://atima.research.bcm.edu/）进行了多样性分析，这是一个用于分析和可视化微生物组数据的独立工具。该软件是一个Web应用程序，结合了公开可用的R包和专门编写的代码，用于导入样本数据并识别分类群丰度、α多样性及其与样本元数据之间的关系。使用非参数Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验（分别用于比较2组或3组及以上）来评估alpha多样性分析中的变量之间的显著差异。α多样性结果通过箱线图可视化，p值使用假发现率（FDR）校正进行调整。β多样性分析使用R函数vegan:adonis版本2.5.5进行Bray-Curtis距离的计算，并通过主坐标分析（PCoA）图进行可视化。β多样性的显著性通过置换多元方差分析（PERMANOVA）进行评估。

对于跨时间点的受试者内纵向比较，首先进行了非参数Friedman检验，必要时进行了配对事后比较。这些方法的选择考虑到了个体内部的重复测量和较小的队列规模。

分类群丰度和差异丰度：
在RStudio（Posit，v2024.x）中使用R（v4.3.2）和ggplot2包生成了多维气泡图，以可视化Ax-2和Ax-3任务中尿液、唾液和粪便样本中的细菌属。数据以长结构格式排列，包括样本类型、受试者ID、任务、时间点、属和相对丰度（%）等列。根据所有时间点的平均丰度选择每个样本类型中前10个最丰富的属。气泡大小按相对丰度（0–100%）缩放，并区分不同样本类型的颜色。应用了 facets包裹来分离不同受试者和任务，以便同时比较时间趋势和受试者特定模式。额外的自定义包括时间点的轴排序、丰度标尺的图例注释以及为了清晰度进行的主题调整。这种可视化提供了多个生物生态位中微生物组成动态的集成视图。

使用MaAsLin3评估了微生物分类群与任务时间点之间的时间关联。对于每个身体部位，分别分析了属级别的相对丰度表。在分析之前过滤了低流行率的分类群，并使用总和比例缩放（TSS）和对数转换对数据进行标准化。考虑了重复采样的因素，将微生物丰度作为时间点的函数进行建模，并使用了受试者特定的随机效应。对于两个任务，L-30作为参考时间点（Ax-2：L-3, R+6；Ax-3：L-2, R+1, R+21）。p值使用Benjamini-Hochberg方法进行调整，q值<0.30被认为对于探索性分析和假设生成是显著的。

全基因组测序：
使用从Ax-2和Ax-3任务中准备的DNA对4个样本进行了全基因组测序（表S2），以验证16S rRNA基因扩增子测序的结果。Illumina配对末端文库在NovaseqX 25B流式细胞仪上准备并测序（2 × 150 bp读长）（表S2）。

Illumina WGS读长的质量和接头剪接使用BBMap版本39.01（https://github.com/BioInfoTools/BBMap）进行。使用BBMap去除人类宿主读长后，使用MetaPhlAn版本4.2.4（https://github.com/biobakery/MetaPhlAn）对WGS样本进行分类群分析。还使用了Kraken2版本2.1.6（https://github.com/DerrickWood/kraken2）对WGS读进行分类群分类，以与MetaPhlAn和16S rRNA测序的结果进行比较。

PBMC分离和单细胞RNA工作流程：
在Ax-2的L-30、L-3和R+1期间（n = 4）以及Ax-3的L-30、L-2和R+1期间（n = 2）收集了血液样本，共计17个样本用于单细胞RNA测序。使用标准GENESTAR协议分离PBMCs，并在冷冻前通过台盼蓝评估活力。使用10x Genomics Chromium平台（Ax-2为v2；Ax-3为v3）生成单细胞5′基因表达文库，并在NovaSeq X系统上进行测序。数据使用Cell Ranger（GRCh38参考基因组）进行处理。单细胞分析数据使用Seurat（v5）按照标准工作流程进行质量控制、标准化、降维、聚类和整合。根据标记基因对细胞群体进行注释，并使用差异表达分析评估细胞因子表达模式。详细的工作流程在配套的手稿中有描述。

血液样本中的细胞因子测量：
在Ax-2和Ax-3任务期间，从四个受试者的L-30、L-3和R+1时间点以及两个受试者的L-30、L-2和R+1时间点收集了血液样本，共使用17个样本进行单细胞RNA测序以评估细胞因子表达。这些数据集的详细信息可以在配套论文中找到。

相关性分析：
为了评估微生物组动态与宿主免疫反应之间的关联，我们在Axiom 2任务中进行了相关性分析，这是唯一一个产生可分析结果的数据集（表S3）。微生物相对丰度进行了CLR转换以考虑组成变化，变化定义为飞行后（R+6）减去飞行前基线（L-30）。细胞因子反应（IL-16和IL-32）计算为飞行后早期（R+1）减去基线（L-30）。因为测量是在略微不同的飞行后时间点收集的，所以比较反映了总体上的飞行后变化，而不是完全匹配的时间点差异。使用皮尔逊相关性分析评估线性关系，名义显著性定义为p值<0.05（表S3），并绘制了受试者水平的相关性分析图（图S7–S9）。由于样本量较少（n = 2），没有对Axiom 3进行相关性分析。

定量和统计分析：
α多样性使用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验（视情况而定）进行评估，并使用FDR校正进行多重比较。β多样性使用基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA进行评估。受试者内的纵向比较使用Friedman检验进行评估，必要时进行配对事后比较。差异丰度使用MaAsLin3和Benjamini-Hochberg校正进行评估，q < 0.30被认为对于探索性分析是显著的。

补充信息（1）：
PDF（1.81 MB）文件S1。包含图S1–S9和表S1–S3。