跨队列转录组分析揭示子宫内膜异位症相关卵巢癌相关病理状态下铁死亡相关转录程序的异质性

《Biomedicines》：Multi-Cohort Transcriptomic Analysis Reveals Heterogeneous Ferroptosis-Related Transcriptional Programs Across EAOC-Associated Pathological States

　　

背景：子宫内膜异位症相关卵巢癌（endometriosis-associated ovarian cancer，EAOC）主要包括在子宫内膜异位症背景下发生的卵巢透明细胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC）和卵巢子宫内膜样癌（ovarian endometrioid carcinoma，OEC），表现出显著的分子异质性。然而，EAOC相关病理状态下铁死亡相关转录特征的组成方式仍不清楚。本研究旨在表征这些病理状态下铁死亡相关转录程序的异质性。方法：研究人员建立了一个横断面多队列转录组框架，包括一个发现队列和三个独立支持队列。在GSE157153中，使用全局评分、基因水平筛选、状态模式聚类、功能和通路分析以及基于网络的风险排序，评估了1809个可检测的FerrDb来源铁死亡相关基因。探索性机器学习分析、独立转录组队列和人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）免疫组化用于补充表征和支持性评估。结果：全局铁死亡相关转录评分在病理状态间仅显示出适度变化，而929个状态相关候选基因被组织成四个具有不同表达模式和不同功能背景的转录程序。这些程序与铁死亡相关代谢、氧化还原和信号通路表现出不同的关联，表明存在异质性转录重塑而非统一的分子转变。网络分析优先排序了七个候选枢纽基因——CDK1、ERBB2、KRAS、PIK3CA、PTEN、JAK2和SRC——分布在多个程序中。探索性机器学习分析和外部支持性评估为选定候选基因提供了异质性的、背景依赖的证据。结论：EAOC相关病理状态下的铁死亡相关转录改变更适合用异质性程序水平结构来表示，而不是用单一的全局指标。这些发现为未来的机制研究提供了转录组框架，但未建立铁死亡特异性功能活性。

子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病，表现为子宫内膜样组织存在于子宫腔外，与特定卵巢癌亚型风险增加相关，尤其是卵巢透明细胞癌（OCCC）和卵巢子宫内膜样癌（OEC），二者构成子宫内膜异位症相关卵巢癌（EAOC）的主要组织学亚型。EAOC表现出显著的分子和临床异质性，但与之相关的生物学过程仍未充分阐明。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡，受铁稳态、抗氧化防御和细胞氧化还原平衡共同调控。在子宫内膜异位症–EAOC背景下，反复出血、铁蓄积和持续氧化应激可能为铁死亡相关分子调控改变提供环境。然而，跨EAOC相关病理状态，铁死亡相关转录改变是呈现为统一的分子转变，还是由异质性转录程序组成，仍不清楚。既往转录组研究常聚焦于个别差异表达基因、预设基因特征或特定信号通路，难以全面捕捉分子异质性背后的协调性、甚至分歧性转录程序。为此，研究人员开展了本研究。

研究人员建立了一个横断面多队列转录组框架，以全面表征EAOC相关病理状态下的铁死亡相关转录模式。发现队列GSE157153包含66例组织样本，涵盖子宫内膜异位症（n=9）、非典型子宫内膜异位症（n=18）、邻近子宫内膜异位症（n=10）和EAOC（n=29）四种预设病理状态。三个独立支持队列GSE230956、GSE141549和GSE73614分别代表互补的组织和病理学背景。通过FerrDb来源的铁死亡相关基因集（共2078个唯一基因，其中1809个在发现队列中可检测），研究人员在基因、转录程序、通路和网络水平进行了系统分析。结果显示，全局铁死亡相关转录评分（FTS）在病理状态间仅有适度变化，而基因水平分析鉴定出929个状态相关候选基因，并进一步聚类为四个具有不同表达模式和功能背景的转录程序。网络分析优先排序出七个候选枢纽基因：CDK1、ERBB2、KRAS、PIK3CA、PTEN、JAK2和SRC。探索性机器学习和外部支持性评估提供了背景依赖的异质性证据。结论表明，铁死亡相关转录改变更适合用异质性程序级结构表示，而非单一全局指标。该研究为未来机制性、细胞分辨和转化研究提供了转录组框架。

关键方法包括：利用公开转录组数据，GSE157153作为发现队列，GSE230956、GSE141549和GSE73614作为支持队列；使用FerrDb来源的基因集构建铁死亡相关基因集合；采用全局转录评分、基因水平筛选（Kruskal–Wallis检验、Spearman相关、Wilcoxon检验）、k-means聚类识别转录程序；进行GO和KEGG富集分析；应用单样本基因集富集分析（ssGSEA）评估通路富集；利用STRING构建蛋白互作网络，并通过CytoHubba的MCC、Degree、EPC算法进行拓扑排序；采用LASSO、随机森林和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）进行探索性机器学习分析；计算候选枢纽基因panel评分（HPS）并进行ROC分析；在外部队列和人类蛋白质图谱（HPA）免疫组化中进行支持性验证。

研究结果如下。3.1 多队列转录组框架和铁死亡相关基因景观：通过四个转录组队列和HPA蛋白证据建立了研究框架。FerrDb来源基因集在GSE157153中的检测覆盖率为87.05%。3.2 跨EAOC病理状态的状态相关铁死亡转录模式：3.2.1 全局FTS显示适度变化，组间差异未达统计学显著（Kruskal–Wallis p=0.0649），但与预设状态顺序有弱正相关（Spearman ρ=0.270，校正p=0.0375）。3.2.2 基因水平筛选鉴定出929个状态相关候选基因。3.2.3 k-means聚类将候选基因分成四个转录程序（Cluster 1 n=199，Cluster 2 n=285，Cluster 3 n=336，Cluster 4 n=109），其表达模式呈递增、递减或非单调趋势。3.2.4 模块评分显示四个程序在病理状态间分布不同，与状态顺序有正向或负向关联且并非单调变化。3.3 功能富集显示不同生物学背景：候选基因整体富集于细胞死亡调控、应激反应和癌症相关通路；四个程序分别富集于线粒体过程、氧化还原与谷胱甘肽代谢、MAPK和PI3K–AKT信号、铁稳态和自噬等不同功能领域。3.4 铁死亡相关通路呈状态富集模式：ssGSEA显示PI3K–AKT–mTOR信号、氧化磷酸化、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、铁死亡相关通路等富集评分在EAOC端较高，而MAPK信号呈相反趋势。3.5 网络优先化识别候选枢纽基因：PPI网络包含914个节点和4131条边，显著高于随机预期。MCC、Degree和EPC三种算法取交集获得7个共识候选枢纽基因，分布于Cluster 4、Cluster 2和Cluster 1，Cluster 3中无候选基因。3.6 探索性机器学习特征化：LASSO保留CDK1、ERBB2、KRAS、PIK3CA、PTEN；随机森林显示CDK1和ERBB2重要性最高；SVM-RFE在二、三、六特征子集获得最高平均交叉验证准确率约0.920。七个基因表达具有异质性，HPS在状态间差异显著但呈非单调变化（Kruskal–Wallis p=8.31×10^?4），EAOC与非EAOC区分的AUC为0.691（95% CI 0.561–0.820）。相关性分析显示HPS与PI3K–AKT–mTOR和氧化磷酸化呈正相关，与MAPK呈负相关，但四个转录程序显示出更广泛且部分相反的通路关联。3.7 外部支持性评估：GSE230956中JAK2和PIK3CA在OCCC中表达倾向较高，ERBB2和SRC倾向较低，但校正后均不显著；GSE141549中JAK2和PIK3CA差异显著，六基因HPS在子宫内膜异位相关组织和对照内膜间有显著差异；GSE73614中CDK1、ERBB2、KRAS和SRC在OCCC和OEC间差异显著，但HPS无显著差异；HPA免疫组化显示七种候选蛋白在卵巢子宫内膜样癌组织中均可检测，但染色模式异质。3.8 整合框架：上述结果综合表明，铁死亡相关转录变异由多个状态相关转录程序组成，并嵌入氧化还原、代谢、线粒体、铁稳态和信号网络等更广泛的生物学背景中。

讨论部分指出，全局评分与基因、程序、通路水平分析之间的对比说明铁死亡相关转录重塑是异质性分子状态，而非统一程序转变。四个转录程序具有不同的功能组成，表明不同EAOC相关病理背景具有不同的铁死亡相关分子配置。候选枢纽基因多为多效性调节因子，参与广泛的癌症相关信号和应激反应，应视为网络优先化的候选特征，而非已验证的铁死亡特异性调节因子。外部支持性队列显示出背景依赖的异质性，说明需要更大规模、病理学匹配的数据集。局限性包括横断面设计无法推断时间进程、公共数据集的异质性、部分外部队列样本量小、缺乏独立外部验证，以及转录组来源的评分不能直接测量铁死亡活性或细胞死亡。结论可翻译为：总之，本研究使用横断面多队列框架描绘了EAOC相关病理状态下铁死亡相关的转录异质性。铁死亡相关的分子变异不是由单一全局指标或统一方向性转变充分代表的，而是被组织为不同的状态相关转录程序，嵌入涉及氧化还原调节、细胞代谢、线粒体过程、铁稳态和信号网络的更广泛背景中。研究进一步识别了七个网络优先化的候选枢纽基因——CDK1、ERBB2、JAK2、KRAS、PIK3CA、PTEN和SRC，外部分析为选定分子特征提供了背景依赖的支持性证据。总体而言，这些发现为解释EAOC相关组织中铁死亡相关分子异质性提供了程序级转录组框架，并为未来的机制性、细胞分辨和转化研究奠定了基础。