牛奶嘌呤衍生物能否反映奶牛尿液嘌呤衍生物-肌酐（PDC）指数？基于牛奶-尿液靶向与非靶向整合筛查的见解

《Italian Journal of Animal Science》：Short communication: do milk purine derivatives reflect the urinary PDC index in dairy cows? Insights from integrative milk–urine targeted and untargeted screening

　　

摘要专业翻译 尿液嘌呤衍生物（purine derivatives，PD）被广泛用作奶牛瘤胃微生物蛋白合成的非侵入性指标，而其作为替代生物体液在牛奶中的应用潜力仍知之甚少。本研究探讨了牛奶PD是否能反映尿液嘌呤代谢，评估了日粮蛋白质降解性对PD谱的影响，并采用整合靶向与非靶向方法探究了牛奶和尿液中协调的代谢响应。研究人员假设日粮蛋白质降解性的差异会诱导两种生物体液中均可检测到的协调代谢变化。研究人员选取9头泌乳荷斯坦奶牛，饲喂瘤胃可降解蛋白（rumen-degradable protein，RDP）与瘤胃不可降解蛋白（rumen-undegradable protein，RUP）比例不同的三种日粮，即CTR（64:36）、SOL（67:33）和BY（57:43），采用靶向和非靶向液相色谱联用高分辨质谱对牛奶和尿液样本进行分析。靶向定量尿囊素、尿酸和肌酐的结果显示，牛奶PD浓度与尿液嘌呤衍生物-肌酐（PDC）指数之间无关联，表明牛奶PD不能直接反映尿液嘌呤代谢。然而，非靶向分析在两种生物体液中均鉴定出与日粮相关的代谢差异，涉及氨基酸代谢相关通路的变化，尤其是在接受高瘤胃不可降解蛋白日粮的奶牛中。利用DIABLO对牛奶和尿液数据集进行整合分析，进一步揭示了跨生物体液和日粮组的协调代谢物模式。总体而言，这些研究结果表明，牛奶PD单独可能不适合作为基于尿液PD评估微生物蛋白合成的替代指标。多种生物体液的整合分析可以揭示日粮蛋白质降解性引起的系统性代谢响应，并为奶牛氮代谢提供互补性见解。

论文解读

一、研究背景与科学问题

在反刍动物中，日粮氮中有相当一部分转化为瘤胃氨，若不能有效被微生物蛋白同化，则被吸收后经肝脏转化为尿素并大量排出，造成氮损失。瘤胃氮利用效率低下通常与瘤胃可降解氮供应和微生物同化之间的失衡有关。嘌呤衍生物（PD）主要来源于微生物核酸降解，包括尿酸和尿囊素，被广泛用作瘤胃微生物蛋白合成和氮利用效率的间接指标。斑点尿液采样结合PD与肌酐比值（PDC指数）为估算PD排泄提供了一种实用方法，因为肌酐排泄相对稳定且与机体蛋白质量相关。日粮蛋白质降解性是影响氮利用的重要因素：瘤胃可降解蛋白（RDP）支持微生物生长和蛋白合成，而瘤胃不可降解蛋白（RUP）逃逸瘤胃降解并贡献肠道氨基酸供应。然而，尿液PD的响应可能因日粮条件、尿量差异、内源性嘌呤代谢以及肾脏对PD的处理和排泄而有所变化。此外，氮分配涉及瘤胃、肝脏和乳腺的协调过程，单一生物基质中的生物标志物可能无法全面捕捉对日粮蛋白质的系统性代谢响应。为此，研究人员提出了F3代谢组学（饲料、体液和食品代谢组学）框架，强调跨基质整合互补代谢组学信息。本研究假设日粮蛋白质降解性差异会诱导两种生物体液中可检测的协调代谢变化，因此对饲喂不同RDP和RUP日粮的泌乳奶牛开展氮代谢研究，采用靶向定量PD和肌酐计算PDC指数并评估生物基质间关系，同时应用非靶向超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）鉴定与日粮蛋白质降解性相关的协调代谢响应和特征。

二、研究设计与技术方法

研究在意大利皮亚琴察的Romeo and Enrica Invernizzi研究中心实验奶牛场开展，时间为2024年2月18日至4月21日。从一项涉及18头奶牛、采用3×3拉丁方设计的更大规模饲养试验中，选取9头泌乳荷斯坦奶牛纳入本子研究，最终获得27份尿液和27份牛奶样本，共54份生物样本。每头奶牛接受三种日粮处理：对照（CTR，16.47%粗蛋白）、高可溶性蛋白（SOL，16.49%粗蛋白）和高过瘤胃蛋白（BY，14.32%粗蛋白），每个处理各9个观测值。每个试验期21天，含7天适应期和14天数据收集期。奶牛自由采食，每日挤奶两次。牛奶样本在每期最后一天早晚挤奶时采集，尿液通过自然排尿斑点采样于清晨饲喂前收集，样本于?20°C保存。靶向分析采用UHPLC联用Orbitrap Q-Exactive Focus高分辨质谱，定量尿囊素、尿酸和肌酐，方法线性范围为25–1000 μg/L（R2>0.99）。非靶向分析采用MS-DIAL v4.90进行峰检测、解卷积、对齐和注释，代谢物通过与牛代谢组数据库ESI阳性谱库匹配进行推定鉴定，鉴定评分≥60%。统计分析采用R 4.4.1，使用线性混合效应模型，日粮处理和试验期为固定效应，奶牛为随机效应。PDC指数根据Chen等的方法按代谢体重（BW^0.75^）调整计算。非靶向数据经log₁₀转换、中位数归一化和Pareto标度化后，采用MetaboAnalyst 6.0进行无监督层次聚类分析，并通过mixOmics包中的DIABLO多模块分析探究协调代谢响应，以VIP评分鉴定判别代谢物，生成Pearson相关网络（|r|≥0.7）可视化牛奶与尿液代谢物间的强关联。

三、主要研究结果

动物生产性能与靶向定量分析。 平均干物质采食量在BY、CTR和SOL组分别为28.9、28.7和28.9 kg/d，平均产奶量分别为45.8、44.0和43.2 kg/d。尿液肌酐、尿酸和尿囊素在BY组数值最高，分别达196.3、507.3和125.6 mg/L。尿液PDC指数范围为约800至1400，CTR、BY和SOL组分别为1375、973和845。然而，尿液肌酐、尿酸、尿囊素和PDC指数均不受日粮处理或试验期影响（p>0.05），这与既往研究一致，表明RUP比例变化不一定影响尿液PDC指数或微生物蛋白合成。与尿液相比，牛奶中PD浓度变异较小。牛奶尿囊素浓度（mg/L）在处理间存在差异（p=0.029），SOL组显著高于CTR组（p=0.036），而BY组与两者均无显著差异，这种差异可能反映产奶量差异而非总尿囊素输出量。

相关性分析。 尿液尿囊素和尿酸在所有日粮组内均呈强相关：CTR（r=0.78；p=0.013）、SOL（r=0.97；p<0.001）和BY（r=0.78；p=0.014），证实了源自微生物核酸的嘌呤降解产物在尿液中协调排泄。相反，牛奶PD之间以及牛奶与尿液PD之间均未观察到显著关系。牛奶尿囊素和尿酸弱相关（r=?0.17，p=0.404），牛奶尿囊素与尿液尿囊素无关联（r=?0.04，p=0.850）。线性混合效应模型显示尿液PDC指数与牛奶PD之间无显著关联。

非靶向代谢组学与DIABLO整合分析。 非靶向UHPLC-HRMS分析鉴定出198种尿液代谢物和147种牛奶代谢物，主要特征为氨基酸衍生物、肽类、羧酸、脂肪酸和核苷酸相关代谢物。DIABLO数据融合显示牛奶和尿液第一潜在成分间相关性为69%，表明存在部分协调的代谢响应，同时保留了基质特异性信息。牛奶中贡献最大的判别特征为肉桂酸（VIP=7.543）、N,N-二甲基甲酰胺（VIP=2.329）、苹果酸（VIP=1.929）、尿素（VIP=1.010）和尿嘧啶（VIP=0.760）。肉桂酸是源自植物次生代谢物和瘤胃微生物转化日粮酚类物质的苯丙烷类化合物，其在BY日粮中的较大贡献可能表明日粮蛋白源对瘤胃微生物代谢和酚类中间体释放的影响。牛奶尿素对SOL日粮的判别贡献更强，与其在全身氮代谢中的作用及较高的RDP供应一致。尿液中贡献最大的判别特征为双（乙酰基）二氨基戊烷（VIP=4.871）、N6-苄基-7H-嘌呤-2,6-二胺（VIP=4.588）、N-乙酰亮氨酸（VIP=3.868）、N-乙酰-L-色氨酸（VIP=2.958）和癸二酸（VIP=0.737）。N-乙酰化氨基酸与尿素循环调节相关，其在BY组中的较高丰度可能表明与更高RUP供应相关的氨基酸分解代谢和肝脏处理增强。层次聚类分析显示，CTR牛奶样本的代谢谱与SOL和BY明显不同，而BY样本在尿液中分化更明显，表明在较高RUP供应下存在与氨基酸和氮代谢相关的更强代谢特征。DIABLO相关网络揭示了若干跨基质关联，其中尿嘧啶和二羟基香豆满酮与尿液代谢物呈最强负相关（Pearson r2FC=0.07），而SOL组呈下降趋势（累积log₂FC=?0.06），BY组甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和脯氨酸等几种非必需氨基酸丰度较高，可能反映RUP增加后乳腺氨基酸周转和利用增强。

四、结论与意义

本研究通过整合靶向和非靶向方法，系统评估了牛奶和尿液嘌呤衍生物与日粮蛋白质降解性的关系。研究结果表明，尿液PD保持了预期的生理关系但未对日粮处理产生响应，且在本试验条件下PDC指数与牛奶PD无关联，牛奶PD单独不适合作为基于尿液PD评估微生物蛋白合成的替代指标。相比之下，基于UHPLC-HRMS的多基质分析揭示了与日粮蛋白质降解性相关的协调代谢响应，并突出了与氨基酸和氮代谢相关的代谢物。将靶向生物标志物与非靶向筛查相结合，可以改善对奶牛氮分配和代谢适应的表征，为氮利用效率的评估提供互补性见解。研究同时指出，需要更大规模的研究来验证潜在的氮利用效率指标。