iRGD修饰工程化天然膜囊泡外泌体递送Torin2靶向治疗间变性甲状腺癌

《International Journal of Nanomedicine》：Engineered Natural Membrane Vesicle Exosomes as a Torin2 Delivery Platform for Targeted Therapy of Anaplastic Thyroid Carcinoma

　　

摘要：背景：间变性甲状腺癌（ATC）是一种高度侵袭性恶性肿瘤，因进展迅速且对常规治疗耐药，预后较差。整合素α_vβ₃在ATC中过表达，使其成为有前景的靶点。Torin2是一种强效哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂，具有抗肿瘤活性，但存在溶解性差、半衰期短和全身毒性等问题。外泌体（exosomes）提供天然递送平台，但缺乏内在肿瘤趋向性。本研究旨在开发iRGD修饰的工程化外泌体，用于将Torin2靶向递送至ATC细胞。方法：通过用编码增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与iRGD肽融合至溶酶体相关膜蛋白2b（Lamp2b）N端的融合蛋白的慢病毒载体（EGFP-C1-iRGD-Lamp2b）转导HEK-293T细胞，制备iRGD修饰外泌体（iRGD-Exos）；Lamp2b为天然富集于外泌体表面的跨膜蛋白。通过电穿孔将Torin2负载入iRGD-Exos（Torin2@iRGD-Exos）。对纳米颗粒的粒径、形态、载药效率和稳定性进行表征。采用流式细胞术和共聚焦显微镜在ATC细胞系中评估细胞摄取。通过活/死细胞染色评估体外细胞毒性。在BHT101异种移植荷瘤裸鼠中考察体内抗肿瘤疗效和生物安全性。结果：iRGD-Exos和Torin2@iRGD-Exos呈球形形态、粒径适宜，载药效率为23.68%。与未修饰外泌体相比，iRGD修饰显著增强ATC细胞对外泌体的摄取。相对于游离Torin2或Torin2@blank-Exos，Torin2@iRGD-Exos表现出更强的体外细胞毒性。体内，与游离Torin2相比，Torin2@iRGD-Exos显著抑制肿瘤生长，且未引起显著体重下降或器官毒性。结论：iRGD修饰外泌体递送系统（Torin2@iRGD-Exos）在体外和体内实现对ATC的高效肿瘤靶向、优异生物相容性和强效抗肿瘤活性，为整合素α_vβ₃高表达恶性肿瘤提供有前景的治疗策略。

论文主体解读：间变性甲状腺癌（ATC）仅占全部甲状腺癌的1%–2%，却贡献近40%的甲状腺癌相关死亡，常规手术、放射性碘治疗、化疗及部分靶向药物带来的生存获益有限，因此亟需更有效和精准的治疗策略。整合素α_vβ₃在ATC细胞及肿瘤相关新生血管上高表达，是主动靶向的理想位点；iRGD肽（CRGDKGPDC）不仅可结合整合素α_vβ₃，还可经蛋白酶切暴露C端规则（CendR）基序并结合神经纤毛蛋白-1（NRP-1），促进跨细胞渗透进入肿瘤实质。外泌体（exosomes）为30–200 nm的细胞外囊泡，具有良好生物相容性、低免疫原性和较长循环时间，但天然外泌体缺乏肿瘤趋向性。Torin2为强效mTOR抑制剂，在包括ATC的肿瘤模型中显示抗肿瘤活性，但水溶性差、体内半衰期短及全身毒性限制其转化。基于此，研究人员构建iRGD修饰的HEK-293T来源外泌体，通过电穿孔负载Torin2，形成Torin2@iRGD-Exos，以增强Torin2生物利用度和肿瘤选择性蓄积。研究结论表明，该体系在体外和体内均实现高效靶向、强效抗肿瘤活性和良好生物安全性，为ATC及整合素α_vβ₃高表达恶性肿瘤提供潜在治疗策略。

开展研究的关键技术方法（不超过250字）：样本队列为2010—2023年青岛大学附属医院病理科10例ATC患者存档福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织及癌旁正常甲状腺组织（7女3男，18–57岁）；ATC细胞系、Nthy ori 3–1及HEK-293T购自武汉Procell；BALB/c裸鼠购自山东鹏悦。关键技术包括：免疫组化评估整合素α_vβ₃表达；Western blot检测细胞表达；慢病毒转导HEK-293T构建iRGD-Exos/blank-Exos，差速超速离心分离外泌体；电穿孔负载Torin2；透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和紫外-可见分光光度法（UV-Vis）表征；PKH26/DiR标记，流式细胞术、共聚焦显微镜及IVIS活体成像评估摄取与靶向；CCK-8和Calcein-AM/PI评估细胞活力；BHT101皮下瘤模型评估抑瘤、体重、血清ALT/Cr及H&E染色。

研究结果：Expression of Integrin α_vβ₃ in ATC：免疫组化分析10对ATC与癌旁组织显示，ATC组织中整合素α_vβ₃表达显著高于癌旁组织；ATC细胞系BHT101、Hth7、Cal62和8505C较正常甲状腺滤泡细胞Nthy ori 3–1高表达，提示ATC适合iRGD靶向策略。Synthesis and Characterization of Torin2 @irgd-Exos：通过慢病毒转导HEK-293T并以差速超速离心获得blank-Exos和iRGD-Exos；NTA显示二者粒径峰值分别为107 nm和114 nm，TEM显示球形且膜结构完整；电穿孔负载Torin2后，TEM仍见球形囊泡，NTA显示粒径增加；UV-Vis在317 nm出现特征吸收峰，载药效率为23.68%。Stability Assessment of Torin2@iRGD-Exos：Torin2@iRGD-Exos在37℃血清和4℃磷酸盐缓冲液中7天内粒径稳定。Enhanced Cellular Uptake of iRGD-Exos in ATC Compared with Blank-Exos in vitro：PKH26标记后流式细胞术显示，iRGD-Exos在BHT101和Cal62细胞中的摄取显著高于blank-Exos，并呈时间依赖性；共聚焦显微镜见胞内点状荧光，证实内化。In vitro Antitumor Effect of Torin2@iRGD-Exos：CCK-8显示iRGD-Exos在0–1000 μg/mL、24 h下对Nthy ori 3–1、Cal62和BHT101细胞活力仍高于95%；Calcein-AM/PI活/死染色显示5 μM Torin2@iRGD-Exos细胞毒性最强，优于游离Torin2和Torin2@blank-Exos，CCK-8验证结果一致。Tumor-Targeting Capability of iRGD-Exos in vivo：BHT101荷瘤裸鼠尾静脉注射DiR标记外泌体后，IVIS成像显示4 h两组肿瘤和肝脏均有信号，24 h仅iRGD-Exos组肿瘤荧光明显；肿瘤感兴趣区定量显示24 h iRGD-Exos显著高于blank-Exos（P<0.001）。Anti-Tumor Efficacy of Torin2@iRGD-Exos in vivo：BHT101皮下瘤模型中每3天静脉给药共3次、观察29天，Torin2@iRGD-Exos显著抑制肿瘤生长，离体瘤体积和瘤重最小；各组体重无显著差异；Torin2@iRGD-Exos组血清ALT和Cr低于游离Torin2组并接近对照；H&E显示主要器官无明显病理改变，肿瘤组织见核浓缩、深染等凋亡特征，表明靶向递送增强疗效并降低毒性。

讨论部分总结：讨论指出，肿瘤微环境致密细胞外基质和不规则血管结构限制化疗药物向深部实质渗透，是耐药的重要挑战；外泌体作为天然纳米载体具有应用潜力。iRGD先高亲和结合整合素α_vβ₃，随后蛋白酶切暴露CendR基序并与NRP-1作用，触发主动跨细胞转运，这一双受体机制区别于传统RGD肽，可能解释本研究中iRGD-Exos更好的肿瘤蓄积和滞留。低剂量Torin2@iRGD-Exos即可有效蓄积并抑瘤，而等剂量游离Torin2或非靶向Torin2@blank-Exos抑瘤作用差。外泌体可经网格蛋白介导内吞、巨胞饮和脂筏依赖途径内化，本研究聚焦治疗结果而非解析各内吞步骤。体内成像还显示外泌体在肝脏明显蓄积，与单核吞噬细胞系统（MPS）尤其Kupffer细胞清除有关，iRGD修饰未完全规避肝摄取，但未见明显肝毒性。选择HEK293T来源外泌体的理由包括高转染效率、可扩展、无肿瘤来源或病原污染、免疫刺激分子水平低及便于基因工程改造。讨论提出，Torin2@iRGD-Exos肝毒性低于游离Torin2可能与缓释、靶向蓄积、库普弗细胞/肝细胞内体-溶酶体隔离及膜保护减少代谢有关；未来需以液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）开展药代和生物分布分析，并研究不同肝细胞群摄取、重复给药长期安全性及外泌体成分对免疫系统的影响。与既往iRGD工程化HEK-293T外泌体共递送多柔比星和放射性碘的平台相比，本研究针对疏水性Torin2和ATC，采用电穿孔载药并靶向阻断PI3K/AKT/mTOR通路，且观察到肝毒性降低，具有新的治疗和安全意义。

研究结论翻译：总之，研究人员开发了一种新型抗肿瘤策略，使用iRGD靶向外泌体作为递送载体，将Torin2高效、精准地递送至ATC细胞。研究人员预期，通过用适当靶向基序工程化外泌体，该方法可扩展至其他疏水药物，实现向肿瘤组织的特异性转运。iRGD工程化外泌体表现出突出的肿瘤靶向能力和治疗功效，为ATC治疗提供新视角，并对多种整合素α_vβ₃高表达肿瘤具有重要潜力。