外泌体策略治疗乳腺癌脑转移：从机制解析到治疗潜力

《International Journal of Nanomedicine》：The Current Landscape of Exosome-Based Strategies for Breast Cancer Brain Metastasis: From Mechanistic Insights to Therapeutic Potential

　　

乳腺癌是一种常见的女性恶性肿瘤。脑转移是晚期严重并发症，具有高发生率和不良预后，尤其是在三阴性乳腺癌和人表皮生长因子受体2（HER2）阳性乳腺癌患者中。目前，手术和放疗是乳腺癌脑转移（BCBM）的主要治疗选择。然而，常规化疗和免疫治疗的有效性受到血脑屏障（BBB）和复杂肿瘤微环境的限制，且有效的治疗策略仍然有限。外泌体是直径为30–150 nm的细胞外囊泡，通过转运蛋白质和核酸等活性分子介导细胞间通讯。它们在肿瘤发生、发展及转移中发挥关键作用。临床前研究表明，外泌体通过多种机制促进BCBM，包括重塑BBB以促进肿瘤细胞跨膜迁移、启动转移前微环境以及外泌体PD-L1介导的全身免疫逃逸。经过基因或化学修饰的工程化外泌体在临床前模型中显示出靶向性和药物递送潜力，使其成为BCBM治疗的潜在候选者。本综述总结了BCBM相关的临床挑战、外泌体的生物学特性及其在脑转移中的作用机制，并讨论了外泌体作为诊断标志物、治疗靶点和药物递送载体的潜力，为未来的研究和临床转化提供见解，这仍具挑战性且需要进一步验证。

外泌体改变脑微环境

外泌体能够穿越BBB进入脑实质，释放内容物并改变脑微环境。肿瘤来源外泌体被器官特异性细胞摄取后，有助于建立转移前微环境。例如，原发性和脑转移性乳腺癌细胞来源的外泌体富含Wnt相关蛋白——细胞迁移诱导和透明质酸结合蛋白（CEMIP），通过上调与脑转移相关的细胞因子和趋化因子，促进促炎性血管微环境。外泌体膜联蛋白II（exo-Anx II）在恶性乳腺癌细胞中高表达，可激活巨噬细胞介导的p38MAPK、NF-κB和STAT3信号通路，增加白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌，从而促进血管生成和乳腺癌转移进展。在转移进展过程中，循环肿瘤细胞来源外泌体可激活GPX3⁺星形胶质细胞，促进IL-1β产生和Th17细胞分化，建立支持BCBM的免疫微环境。高侵袭性乳腺癌细胞来源的外泌体miR-221-3p可靶向白血病抑制因子受体，诱导内皮细胞糖酵解、破坏紧密连接并增加屏障通透性。肿瘤相关巨噬细胞通过STAT和NF-κB等信号通路促进缺氧和代谢重编程，破坏BBB，并通过ANGPTL4和MMP9等分子介导免疫逃逸。此外，外泌体miRNA-503可诱导小胶质细胞M1–M2极化，上调免疫抑制细胞因子表达，抑制T细胞增殖。

非实质细胞来源外泌体同样参与BCBM。间充质基质/干细胞来源脂肪细胞外泌体通过灭活Hippo激酶级联，导致YAP/TAZ激活和核转位，促进乳腺癌细胞增殖和迁移，并保护其免受化疗诱导的凋亡。脂肪组织来源间充质细胞经血管内皮生长因子刺激后分泌富含miR-132的外泌体，促进淋巴管生成和新生血管形成。在胰岛素抵抗条件下释放的脂肪来源外泌体通过miRNAs驱动上皮–间质转化，促进BCBM。星形胶质细胞来源外泌体miR-19a可被脑转移乳腺癌细胞摄取，可逆性下调PTEN表达，增加CCL2分泌和骨髓细胞聚集，最终促进脑转移。肿瘤来源外泌体携带的PD-L1可与T细胞上的PD-1结合，抑制抗肿瘤免疫应答。Munc13-4是PD-L1分选和外泌体分泌的关键调控因子，在干扰素-γ信号下与多种蛋白协同作用。Munc13-4敲除或破坏Munc13-4–PD-L1相互作用可增强抗肿瘤免疫、抑制肿瘤生长并改善免疫检查点抑制剂疗效。总之，肿瘤细胞、非实质细胞与转移微环境之间的外泌体介导相互作用促进了BCBM进展。

外泌体参与BBB调控

向脑内靶向递送药物是治疗脑部疾病的主要挑战，这源于BBB的选择性结构和功能特性。肿瘤来源EV可通过主动转胞吞穿越BBB，这一发现挑战了BBB对大分子不可渗透的传统观点，为研究脑转移机制和开发递送载体提供了基础。脑内皮细胞之间的紧密连接构成BBB的结构基础，调节分子进入大脑。BBB内皮细胞表达多种离子转运体和通道，介导钠、钾、氯和钙的运动，这些转运体在管腔侧和管腔侧膜上不对称分布，实现离子跨屏障的定向跨细胞运动。

脑转移的建立依赖于转移性癌细胞与脑基质细胞之间的复杂细胞间串扰。脑趋向性MDA-MB-231-luc-D3H2LN亚系分泌外泌体，将miR-181c递送至脑内皮细胞，通过下调靶基因PDPK1，导致肌动蛋白定位异常、紧密连接蛋白分布改变和细胞间连接受损，从而增加BBB通透性。乳腺癌细胞来源外泌体含有长链非编码RNA（lncRNA）GS1-600G8.5，可被脑内皮细胞内化，导致ZO-1、Claudin-5和N-钙粘蛋白表达降低。MDA-MB-231来源外泌体将miR-105转移至人微血管内皮细胞，导致ZO-1下调、紧密连接破坏和BBB通透性增加。此外，乳腺癌细胞中TTLL4上调促进外泌体分泌，从而增加BBB通透性并增强乳腺癌细胞与脑内皮细胞的粘附，使肿瘤细胞更易穿越BBB。乳腺癌来源外泌体还可直接调节BBB内皮的去粘附特性。脑趋向性乳腺癌细胞释放的EV可通过转胞吞穿越BBB，导致脑转移。尽管这些发现支持外泌体调节BBB完整性的能力，但外泌体跨BBB转胞吞的精确分子机制以及各货物在体内的定量贡献仍有待充分阐明。鉴于BBB破坏是BCBM的早期事件，靶向调节BBB是一种值得进一步研究的潜在治疗策略，外泌体的BBB穿透特性可被用于开发靶向递送系统。

外泌体作为BCBM的生物标志物和治疗靶点

液体活检已成为检测肿瘤来源标志物的有前景的方法。癌细胞释放的外泌体携带丰富的肿瘤特异性遗传物质，包括基因组DNA、mRNA和miRNA，并参与重塑TME。这些特征使外泌体成为癌症诊断、预后分层和治疗指导的潜在候选者。临床证据表明，循环外泌体PD-L1可作为监测乳腺癌疾病进展和转移潜力的外周生物标志物，为液体活检监测提供潜在指标。外泌体整合素β₃水平升高与脑转移前龛重塑相关，可能作为预测BCBM的循环标志物。对乳腺癌脑转移患者临床标本的分析显示，循环外泌体中hsa-miR-576-3p显著上调和hsa-miR-130a-3p下调；外泌体hsa-miR-340-5p与Ki-67增殖指数正相关，而hsa-miR-342-3p表达与病理肿瘤分期负相关。此外，hsa-miR-18a-3p是区分恶性乳腺癌与良性乳腺纤维腺瘤的潜在生物标志物。

然而，这些候选生物标志物的临床有效性尚不充分。大多数报告来自单中心、回顾性且样本量有限的研究，很少有研究报告敏感性、特异性或曲线下面积等关键诊断性能指标。独立的前瞻性验证在大样本、特征明确的队列中基本缺乏。此外，分析可重复性是一个主要问题：外泌体分离方法（包括超速离心、尺寸排阻色谱和免疫亲和捕获）和检测平台在不同研究中差异很大。血液采集、储存、外泌体miRNA定量和归一化策略等分析前因素未标准化。全身炎症、代谢状态和既往治疗等混杂因素可能影响外泌体货物，提示未来验证研究需仔细进行协变量校正。这些局限性目前阻碍了跨研究直接比较及候选外泌体标志物向常规临床实践的转化。

重要的是，外泌体分子也在功能上参与BCBM，尽管证据主要是机制性的而非诊断性的。肿瘤来源外泌体CEMIP诱导星形胶质细胞活化和脑实质内转移前龛形成，促进乳腺癌细胞脑定植。肿瘤来源外泌体miRNAs也可破坏BBB，如miR-181c通过下调PDPK1破坏BBB完整性，miR-105下调ZO-1并增加BBB通透性，miR-221-3p靶向LIFR诱导内皮糖酵解和破坏紧密连接。含有lncRNA GS1-600G8.5的乳腺癌细胞外泌体降低脑内皮细胞中ZO-1、claudin-5和N-钙粘蛋白表达。胰岛素抵抗脂肪细胞外泌体富含miR-145a-3p，靶向紧密连接蛋白occludin和肿瘤抑制因子Trp53bp2，提示循环外泌体miR-145a-3p可能反映脂肪组织胰岛素抵抗并预测合并2型糖尿病的TNBC患者转移风险。乳腺癌来源膜联蛋白II促进巨噬细胞介导的p38MAPK、NF-κB和STAT3通路激活，增加IL-6和TNF-α分泌，促进血管生成和转移进展。用膜联蛋白II缺失外泌体预处理可使脑转移减少约四倍、肺转移减少约两倍，表明外泌体膜联蛋白II是转移性乳腺癌的潜在治疗靶点。TTLL4是一种介导β-微管蛋白多聚谷氨酰化的微管蛋白酪氨酸连接酶样酶，在HER2阳性和TNBC亚型中显著上调。TTLL4过表达细胞来源外泌体通过调节ICAM-1等粘附分子，促进肿瘤细胞与脑内皮细胞粘附，增加BBB通透性，从而形成促进脑转移的转移前微环境。上述分子最好被视为可能指导生物标志物开发的机制性中介，而非已验证的生物标志物。对于大多数分子，证据来自体外或动物模型，其在患者循环中的存在和诊断性能尚未系统评估。总之，外泌体包裹的特定货物（包括miRNAs和蛋白质）在BCBM诊断和预后的探索性研究中显示出作为辅助生物标志物的潜力，但针对BCBM特异的外泌体miRNA和蛋白质谱的研究仍有限，需要更全面的研究促进基于外泌体的生物标志物临床转化。

工程化策略在BCBM中的应用

工程化外泌体是天然分泌的EV，具有低免疫原性和良好生物相容性，适合作为药物载体。通过表面工程，外泌体可特异性识别乳腺癌细胞或脑微环境组分，从而提高治疗效果。工程化外泌体可同时携带药物、siRNA和miRNA等核酸以及蛋白质，实现多模式治疗。例如，ANG肽修饰的负载齐墩果酸外泌体可高效穿透BBB并靶向乳腺癌脑转移灶，通过下调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）诱导肿瘤细胞铁死亡，显著抑制脑转移并延长小鼠生存期，且全身毒性较低。在亲代癌细胞中，GPR143（一种非典型G蛋白偶联受体）直接调控ESCRT复合体——负责将整合素和EGFR等特定货物蛋白分选包装到外泌体中的核心复合体。受体细胞摄取这些外泌体后，激活整合素/FAK/Src信号轴，促进癌细胞迁移、侵袭和转移。这些研究从表面修饰到内在货物分选途径调控多个层面展示了外泌体的治疗潜力。

作为药物递送系统，工程化外泌体可包封紫杉醇和多柔比星等化疗药物，通过靶向修饰递送至脑转移灶，从而降低全身毒性。此外，工程化外泌体可运输抗炎因子和免疫调节分子，抑制脑TME中的促转移信号。外泌体介导的miR-145递送可抑制星形胶质细胞的促转移作用。工程化外泌体还可装载荧光标记物或磁性纳米颗粒，用于乳腺癌脑转移成像和诊断，实现转移部位外泌体蓄积和定位的实时监测。对于HER2阳性乳腺癌脑转移，CAR-NK细胞来源外泌体结合纳米材料包封，通过表面修饰HER2靶向肽，可穿越BBB并选择性靶向HER2阳性乳腺癌细胞。来源于转分化神经干细胞的基因工程外泌体可携带TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL），与游离TRAIL相比，工程化外泌体Exo-iNSC-TRAIL能更有效清除转移性和原发性脑癌细胞并显著提高生存率。

与合成纳米载体相比，外泌体具有独特优势。与脂质体和聚合物纳米颗粒不同，外泌体因内源性来源而表现出低免疫原性、天然靶向能力和穿越生物屏障（如BBB）的能力。外泌体还表现出比脂质体更优的生物相容性和BBB穿透性，特别适合中枢神经系统递送。然而，外泌体血浆半衰期短（通常2–30分钟），主要蓄积于肝脏和脾脏。聚合物纳米颗粒通常具有更高的载药量、更可调的释放动力学和更易大规模制造，但免疫原性风险增加。细胞膜包被纳米颗粒是另一种仿生策略，保留来源细胞表面标志物并可模拟特定细胞功能，但通常比外泌体更大更硬，膜包被均匀性较差。白细胞模拟纳米囊泡可主动靶向炎症或肿瘤组织并具有强免疫逃逸能力，但规模化生产和批次一致性仍具挑战。因此，选择递送平台取决于治疗适应证、靶组织和制造限制。

目前，工程化外泌体的大规模生产和纯化技术需进一步优化。提高工程化外泌体的靶向特异性和穿越BBB效率仍是重大研究挑战。外泌体分离方法（超速离心、超滤、尺寸排阻色谱或免疫亲和捕获）直接产率和纯度，并影响下游实验结果。货物装载方法（电穿孔、超声、共孵育和挤出）可产生不同装载效率，提高效率可能损伤囊泡或使货物失活。此外，用靶向配体（如叶酸、iRGD或狂犬病病毒糖蛋白肽）修饰外泌体可改善组织特异性，但实现适当的配体密度和方向需要大量优化。脂双层可保护核酸和蛋白质货物免于降解，但细胞内货物释放的机制和时机仍不完全清楚。全身注射后，大多数外泌体蓄积于肝脏、脾脏和肺，而非肿瘤部位。药代动力学方面，未修饰外泌体从循环中快速清除且半衰期短，可能需要表面工程延长全身暴露而不损害安全性。在制造层面，在无菌条件下大规模生产外泌体并保持批间一致质量仍具挑战。供体细胞变异和外泌体异质性进一步复杂化标准化产品开发。此外，大多数研究仍处于临床前阶段，临床试验数据有限。长期安全性和潜在免疫原性也需进一步评估。肿瘤来源外泌体携带致癌货物，可促进血管生成、EMT、侵袭、转移和化疗耐药，限制其作为药物载体的适用性。免疫原性是另一个考虑因素，外泌体保留亲本细胞表面蛋白，可能触发免疫激活。储存方面，外泌体通常需在?80 °C下储存，反复冻融循环可破坏膜完整性并导致货物泄漏，且缺乏临床级货架期数据。最后，EV药物监管指南的缺失使制造标准和临床试验要求方面存在未定义之处。

结论

外泌体在BCBM中发挥重要作用，包括转移前龛形成、BBB重塑、TME调节和免疫逃逸。外泌体及其内容物（包括miRNAs和蛋白质）可能成为BCBM的治疗靶点。或者，抑制外泌体释放或阻断其与靶细胞相互作用可能有助于预防脑转移。通过基因工程或化学修饰产生的工程化外泌体具有靶向特异性、药物载量和功能调节特性，使其成为BCBM干预的有前景的临床前工具。然而，其临床相关性仍受若干挑战制约：外泌体群体异质性及缺乏普遍接受的分离、纯化和质量控制方案，对标准化和可重复性构成挑战；良好生产规范条件下的大规模制造在技术上仍具难度，特别是核酸和疏水药物的高效装载需进一步优化；长期免疫原性和潜在脱靶效应等安全性问题尚未在临床环境中系统评估；缺乏强有力的临床试验数据，大多数研究仍处于临床前阶段，支持工程化外泌体在BCBM患者中安全性和有效性的证据不足以指导临床决策。解决这些挑战需要标准化、可规模化生产、严格安全性评估和设计良好的早期临床试验方面的协同努力。随着技术进步和转化研究扩展，工程化外泌体可能为BCBM新治疗方案的开发做出贡献，但仍需严格的临床评价来确定其在患者中的可行性。