千足之下的万千谜团：利用 UCEs 厘清倍足动物门的系统关系

《iScience》：A myriad of mysteries on many legs: Disentangling the systematics of Myriapoda with UCEs

　　

# 要点

- 开发了一套用于多足纲类群的新型超保守元件探针组
- 重建了23/24个多足纲目的系统发育关系
- 佐证了罕见的虹管虫目和虹鳃目的系统发育位置

# 摘要

多足纲是最古老且多样性最高的节肢动物类群之一，包括倍足纲、唇足纲、原足纲和短翅目四个纲。传统的系统发育分析在采用不同方法（即形态学、Sanger测序和转录组学）研究亚纲内各类群的分类地位与系统关系时，结果往往存在分歧。在此，我们开发了一套面向多足纲的新型UCE（超保守元件）探针组，取样了虹鳃目和虹管虫目——其中最稀有的倍足类类群——并探讨了革脚目内的科级系统发育关系。该探针组在体外测试中针对63份新样本以及已发表的转录组和基因组数据（涵盖24个多足纲目中的23个目）进行了验证。我们平均恢复了每个末端666个位点，重建的系统发育树识别出两种替代的纲级拓扑结构，倾向于将倍足纲作为短翅目+原足纲的姐妹群。我们佐证了虹管虫目在Polyzoniida内的位置，以及虹鳃目作为Stemmiulida的姐妹群。该探针组在多个分类层级上表现出高度的系统发育效用，使研究人员能够解决多足纲进化领域的悬而未决的问题。

# 图文摘要

# 引言

多足亚纲是理解节肢动物进化历史的重要谱系。作为泛甲壳类的姐妹群（参见前作研究），共同构成颚肢类——即具有颚口器的节肢动物——多足纲是动物界最多样化的谱系之一的重要组成部分，目前已描述超过18,500个有效物种（14,245种倍足纲、3,300种唇足纲、200种原足纲和850种短翅目，http://www.millibase.org），其身体结构的差异如图1所示。多足纲是已知最古老的陆生动物，苏格兰化石中的原始多足类倍足类 *Cowiedesmus eroticopodus*、*Albadesmus almondi* 和 *Pneumodesmus newmani* 可追溯至中志留世。尽管多足纲在节肢动物中的分类位置在历史上一直存在争议，但目前广泛接受的是，四个亚群——较为人所知的唇足纲（蜈蚣）和倍足纲（马陆），以及较小的原足纲和短翅目——代表一个单系群。然而，这些谱系之间的系统关系在不同系统发育研究中仍然不稳定。

**图1** 多足纲主要谱系代表的照片

（A–I）Aotearoa | 新西兰Hunua山脉的 *Pauropus* sp.（短翅目）；Aotearoa | 新西兰Tuatapere Scenic Reserve的 *Hanseniella* sp.（MCZ:IZ:151825）（原足纲）；新加坡乌敏岛的 *Eudigraphis* sp.（倍足纲，Penicillata，Polyxenida）；南非Mpenjati自然保护区的 *Sphaerotheriidae* *giganteum*（倍足纲，Pentazonia，Sphaerotheriida）；西班牙加那利群岛特内里费岛的 *Hirudicryptus canariensis*（倍足纲，Colobognatha，Polyzoniida［原属Siphonocryptida］）；牙买加蓝山国家公园的 *Anadenobolus monilicornis*（倍足纲，Juliformia，Spirobolida）；墨西哥瓦哈卡的 *Dendrothereua linceci*（MCZ:IZ:73389）（唇足纲，Scutigeromorpha）；牙买加金斯顿的 *Scolopocryptops ferrugineus*（唇足纲，Scolopendromorpha）；澳大利亚塔斯马尼亚Pieman River州立保护区的 *Craterostigmus tasmanianus*（MCZ:IZ:164621）（唇足纲，Craterostigmomorpha）。图片（A–D及F–I）由G.G.拍摄，（E）由P.R.-F.拍摄。MCZ = 比较动物学博物馆，IZ = 无脊椎动物学馆藏。

进入基因组时代后，少数研究利用多基因核数据集考察了多足纲的种间关系和/或其分类地位，随后又有基于转录组或基因组的研究。不同类型的研究方法支持了不同的进化假说。Fernández等人的首个基于转录组的多足纲系统关系分析提出了两种替代拓扑结构，要么将倍足纲-唇足纲与原足纲归为一组作为外群，要么将原足纲与倍足纲更为接近；短翅目未纳入该研究。后续的转录组分析支持了短翅目-原足纲（= Edafopoda）的姐妹群关系，以及唇足纲-倍足纲（= Pectinopoda）的姐妹群关系。最近，Kück等人重新分析了Szucsich等人组装的转录组多足纲数据集——不明原因地忽略了Benavides等人的数据和结论——除传统的最大似然法外，还采用了基于四元组的抽样方法。他们用传统方法识别出C + D（唇足纲 + 倍足纲）和S + P（原足纲 + 短翅目）互为姐妹群的支持证据，但在四分体分析中采用更严格的特征状态过滤后，对单系的Progoneata（短翅目 + 原足纲 + 倍足纲）获得了更高支持度，其中短翅目和原足纲被解析为姐妹群。尽管这些近期进展在一定程度上澄清了多足纲的拓扑结构，但关于这些大类群的位置以及多足纲四个纲内部系统发育关系的多个方面仍然存在不确定性。此外，较少见且了解较少的多足纲目的系统发育身份也存在争议，如塔斯马尼亚和新西兰的孑遗火山虫目蜈蚣——这是该蜈蚣谱系中唯一的成员。这个包含两个物种的类群此前曾被归入Epimorpha（Scolopendromorpha + Geophilomorpha，即孵化时具有完整体节数的蜈蚣），构成更大的Phylactometria（具有育幼行为的蜈蚣）。然而，遗传数据反复产生矛盾的关于这一分类位置的结果，无论使用少数标记的Sanger测序还是系统基因组数据集。关于倍足纲，直到最近，稀有的倍足纲目Siphoniulida和Siphonocryptida从未在分子系统发育中被评估——在此我们帮助为这两个类群提供新数据——以使我们的系统发育树覆盖所有倍足纲目。

序列捕获系统发育学的进步，特别是超保守元件（UCEs）的使用，最近扩展了我们在10-1000个位点上对多种谱系进行详细多层次进化分析的能力。这些方法虽然很有启发性，但依赖于高质量的、针对特定类群的探针组来靶向这些位点。最初为四足动物开发的UCE探针组，此后已应用于多种无脊椎动物谱系，包括螯肢动物、多种蛛形纲探针组（一种蛛形纲通用探针组、蜘蛛目、螨纲和盲蛛纲）、有爪动物、双壳纲、各种昆虫谱系、珊瑚虫纲、异鳃目、十足目和负子目。这些工具大大推进了我们对广泛分类群体中生物多样性的理解。一种通用的后生动物UCE探针组被全新设计和开发，以促进在整个动物生命树中的系统基因组学可及性，并旨在降低系统基因组研究的门槛，因为UCE探针组可能费用高昂，且上述群体之外的类群无法获得。尽管如此，能够增加靶向位点数量和特异性的类群专用探针组，还允许研究人员纳入更大比例的珍贵历史博物馆标本，这些标本的DNA更为片段化，且此前可能无法获取数据进行提取和分析。

作为一个高度多样化且极其古老的类群，多足纲仍有许多广度和细粒度的进化问题有待厘清，它是一个可以借助UCE探针组来阐明不同分类深度关系的合理谱系。虽然Metazoa探针组被发现能够恢复多足纲UCE位点（使用 *Scolopendra morsitans* 的体外测试恢复了524个位点），但据推测，一种更有针对性的探针组能更好地适配、恢复和重建从亚纲到物种水平的系统发育关系，横跨遗传差异较大的类群，正如为蛛形纲内部各目开发的蛛形纲亚探针组所示。

在此，我们展示了一套面向多足纲的新型UCE探针组的设计与实证测试，旨在重建跨越几乎所有蜈蚣、马陆、短翅目和原足纲目代表的多足纲科级系统发育树。我们的分析从亚纲水平到物种水平探讨系统关系，后者尤其聚焦于Scutigeromorpha，并重点解决被假定为倍足纲目的Siphoniulida和Siphonocryptida的分类位置。继其他近期成功破译复杂分类问题的已发表UCE探针组之后，我们希望将此工具推广到多足纲系统发育学中的类似难题。

# 结果

## 计算测试后的位点恢复

在此，我们展示了一套针对所有纲的多足纲探针组，包含19,997个诱饵，靶向1,087个位点。在初步计算测试中，恢复的UCE位点数从 *Sigmoria abbotti* 的9个到 *Trigoniulus corallinus* 的1,051个不等（表S1）。大多数物种获得了中等恢复值（300-700个位点），而一小部分显示出低恢复值（<200个位点）。最高恢复值在多个类群中超过900个位点（表S1）。位点恢复的差异主要与分析数据的类型（基因组与转录组）有关。基于基因组的样本平均恢复了1,012个位点，而基于转录组的样本平均恢复了317个位点。转录组之间的差异可能反映了组装质量、与基础基因组的分歧以及靶向区域不完整表征的差异。对于外群样本 *Phalangium opilio*（盲蛛目），计算中恢复了925个位点，表明许多靶向位点超出了多足纲的范围，在其他节肢动物中也存在（表S1）。

## 体外测试后的位点恢复

对于体外测试的标本，恢复的原始位点平均数量为776个，从 *Abacion magnum* 的60个到 *Thereuopoda clunifera*（MCZ:IZ:130928，唇足纲：Scutigeromorpha）的1,025个不等；革脚目目相较于其他多足纲类群恢复率更高，平均恢复945个原始位点（表2）。低恢复率类群包括前述的 *Abacion magnum* 和 *Cleidogona* sp.（MCZ:IZ:165604，倍足纲：Chordeumatida），各恢复64个位点；这些是唯一在体外测试中恢复少于100个位点的类群。

## 矩阵构建的位点恢复

我们最终数据集（包含基因组和转录组）中捕获的原始位点平均数为666个，从 *Abacion magnum*（MCZ:IZ:165592；倍足纲：Callipodida）的60个到 *Alipes grandidieri*（基因组GenBank: GCA_023313115.1，唇足纲：Scolopendromorpha）的1,047个不等（表1）。包含所有体外标本、基因组和转录组的四个纲的平均值如下：短翅目 = 510，原足纲 = 475，唇足纲 = 755，倍足纲 = 597。50%填充率矩阵包含平均558个位点（352,145个核苷酸位点），60%填充率矩阵包含342个位点（207,642个核苷酸位点），70%填充率矩阵包含40个位点（23,224个核苷酸位点）（表2）。位点恢复率的急剧下降可归因于多足纲谱系间的分类多样性以及跨纲的全面取样。比较转录组学、基因组学和体外取样恢复率时，我们发现体外标本平均具有最高的恢复值，恢复了776个位点（n体外 = 63），基因组为684个位点（但包含外群，n基因组 = 11），转录组为422个位点（n转录组 = 30）（表2）。在所有多足纲纲中，短翅目（其次是原足纲）在我们的数据集中代表性最小（表2）。由不同类群UCE变异生成的Smilogram描绘了不同分类水平的碱基变异，例如 *Scutigera coleoptrata* 在共享的1,104个位点间显示出可检测的、具有系统发育信息价值的种内变异（图2）。使用中间gblocks参数设置（标签：--b1 0.5 --b2 0.5 --b3 6 --b4 6）的平均位点长度为901 bp，GC含量为41.76%，处于优化设计的探针组范围内。

**图2** 多足纲类群选定的UCE Smilogram

（A–D）不同分类水平的多足纲UCE Smilogram，描绘了碱基频率随距UCE位点核心距离的变化。展示的Smilogram为：（A）Scutigeromorpha全目所有位点（n = 20），（B）*Scutigera coleoptrata* 种内所有位点（n = 4），（C）Pentazonia下所有位点（n = 6），（D）*Craterostigmus* 属所有位点（n = 3）。

| 物种 | 目 | 代码 | N50 | BUSCO | RAA |
|------|----|------|-----|-------|-----|
| *Australiulus tonginus* | Julida | Anaton | 2361 | 187 | SAMN13697698 |
| *Glomeris maerens* | Glomerida | Glomae | 1032 | 38 | 1.5 | SRR14842607 |
| *Hanseniella* sp. | Symphyla | Hansen | — | — | SRR17085349 |
| *Helicorthomorpha holstii* | Polydesmida | Helhol | 18119 | 263 | 91.8 | SAMN12705546 |
| *Lithobius niger* | Lithobiomorpha | Litnig | 3464 | 163 | 93.4 | SAMN19759499 |
| *Niponia nodulosa* | Polydesmida | Nipnod | 1448 | 580 | 4 | SAMN14090057 |
| *Pauropus huxleyi* | Tetramerocerata | Pauhux | — | — | SRR6145369 |
| *Rhysida immarginata* | Scolopendromorpha | Rhyimm | 9568 | 697 | 8.6 | SAMN17847797 |
| *Strigamia maritima*? | Geophilomorpha | Strmar | 13945 | 193 | 8 | SAMN00009008 |
| *Thereuonema tuberculata* | Scutigeromorpha | Thetub | 7076 | 1429 | 80.3 | SRR13637550 |
| *Trigoniulus corallinus* | Spirobolida | Tricor | 2678 | 7286 | 85.9 | SRR14493596 |

**表1** 用于探针组设计和计算测试的基因组和转录组

统计量包括中位长度（N50）、BUSCO完整度评分、NCBI登录号和参考文献。

**加粗**的物种和代码表示设计来源为非基因组数据（即转录组）；\*，碱基基因组。

**在新标签页中打开表格**

| 纲/目 | 科 | 物种 | 来源 | 凭证号 | SRA | 基因组登录号 | 原始UCE | 50p UCE | 60p UCE | 70p UCE |
|-------|-----|------|------|--------|-----|------------|---------|---------|---------|---------|
| 甲壳纲 | 四角亚目 | 宽甲壳科 | *Acopauropus ornatus* | T | – | SRR3485973–39 | | 320 | 189 | 16 | – | – |
| | | *Eurypauropus* sp. | NMCZ:IZ:165607 | SAMN57413 | | 199 | – | 647 | 50 | 83 | 16 | 43 |
| | 甲壳目 | *Pauropus huxleyi* | NMCZ:IZ:141222 | SAMN57413 | | 200 | – | 490 | 40 | 42 | 62 | 33 |
| 唇足目 | – | 有颚唇足科 | *Scolopendrellopsis subnuda* | G | – | – | GCA_034694405.1 | 777 | 590 | 359 | 43 | – | – |
| | | *Symphylella* sp. | T | – | SRR1653241–40 | | 433 | 120 | 32 | 6 | – | |
| | 圆唇足科 | *Hanseniella nivea* | T | – | SRR3485984–39 | | 131 | 221 | 32 | 9 | – | – |
| | | *Scutigerella* sp. | NMCZ:IZ:165594 | SAMN57413 | | 201 | – | 630 | 46 | 42 | 95 | 37 |
| | | *Scutigerella* sp. | TMCZ:IZ:46890 | SRR3458649 | – | 174 | 145 | 80 | 1 | 2 | | |
| 唇足纲 | 板唇足亚目 | 板唇足科 | *Craterostigmus crabili* | NMCZ:IZ:71256 | SAMN57413 | | 202 | – | 805 | 70 | 94 | 40 | 52 |
| | | *Craterostigmus tasmanianus* | T | – | SRR1157986–42 | | 537 | 62 | 28 | 2 | 6 | – | – |
| | | *Craterostigmus tasmanianus* | T | – | SRR2774008–42 | | 436 | 121 | 0 | 3 | 1 | | |
| | 石蜈蚣亚目 | 扁石蜈蚣科 | *Sphendononema guildingii* | NMCZ:IZ:133578 | SAMN57413 | | 203 | – | 542 | 48 | 23 | 10 | 36 |
| | | *Sphendononema rugosa* | NMCZ:IZ:130922 | SAMN57413 | | 204 | – | 974 | 80 | 0 | 48 | 45 | 5 |
| | 石蜈蚣科 | *Allothereua bidenticulata* | NMCZ:IZ:130863 | SAMN57413 | | 205 | – | 996 | 84 | 65 | 0 | 25 | 3 |
| | | *Dendrothereua nubila* | NMCZ:IZ:130879 | SAMN57413 | | 206 | – | 818 | 66 | 83 | 86 | 40 | – |
| | | *Lassophora nossibei* | NMCZ:IZ:130917 | SAMN57413 | | 207 | – | 1,009 | 87 | 0 | 50 | 85 | 7 |
| | | *Parascutigera festiva* | NMCZ:IZ:130888 | SAMN57413 | | 208 | – | 992 | 86 | 0 | 51 | 35 | 6 |
| | | *Parascutigera* sp. | NMCZ:IZ:151578 | SAMN57413 | | 209 | – | 940 | 79 | 44 | 83 | 54 | – |
| | | *Parascutigera sphinx* | NMCZ:IZ:130898 | SAMN57413 | | 210 | – | 835 | 72 | 34 | 33 | 48 | – |
| | | *Pilbarascutigera incola* | NMCZ:IZ:130864 | SAMN57413 | | 211 | – | 961 | 82 | 94 | 95 | 55 | – |
| | | *Scutigera coleoptrata* | NMCZ:IZ:130906 | SAMN57413 | | 212 | – | 1,002 | 82 | 0 | 49 | 55 | 3 |
| | | *Scutigera coleoptrata* | NMCZ:IZ:130909 | SAMN57413 | | 213 | – | 973 | 78 | 64 | 76 | 56 | – |
| | | *Scutigera coleoptrata* | NMCZ:IZ:130915 | SAMN57413 | | 214 | – | 982 | 77 | 54 | 66 | 54 | – |
| | | *Scutigera coleoptrata* | NMCZ:IZ:130916 | SAMN57413 | | 215 | – | 948 | 76 | 14 | 60 | 51 | – |
| | | *Tachythereua* sp. | NMCZ:IZ:142970 | SAMN57413 | | 216 | – | 1,023 | 87 | 55 | 15 | 57 | – |
| | | *Thereuonema tuberculata* | NMCZ:IZ:130925 | SAMN57413 | | 217 | – | 1,002 | 85 | 85 | 12 | 56 | – |
| | | *Thereuonema turkestana* | NMCZ:IZ:130927 | SAMN57413 | | 218 | – | 1,004 | 83 | 54 | 91 | 52 | – |
| | | *Thereupoda clunifera* | NMCZ:IZ:130928 | SAMN57413 | | 219 | – | 1,025 | 89 | 25 | 19 | 57 | – |
| | | 石蜈蚣科 | *Scutigerina hova* | NMCZ:IZ:130880 | SAMN57413 | | 220 | – | 1,002 | 81 | 84 | 97 | 52 | – |
| | | | *Scutigerina malagassa* | NMCZ:IZ:130937 | SAMN57413 | | 221 | – | 996 | 81 | 04 | 96 | 54 | – |
| | | | *Scutigerina weberi* | NMCZ:IZ:32088 | SAMN57413 | | 222 | – | 875 | 76 | 94 | 76 | 52 | |
| | 球唇足亚目 | 扁唇足科 | *Anopsobius giribeti* | TMCZ:IZ:35360 | SRR3232683 | – | 564 | 476 | 298 | 35 | – | – |
| | | | *Anopsobius neozelanicus* | NMCZ:IZ:133375 | SAMN57413 | | 223 | – | 811 | 71 | 54 | 54 | 52 | – |
| | | 球唇足科 | *Lithobius forficatus* | NMCZ:IZ:131534 | SAMN57413 | | 224 | – | 967 | 80 | 54 | 83 | 51 | |
| | 地蜈蚣亚目 | 无齿唇足科 | *Aphilodon weberi* | NMCZ:IZ:131547 | SAMN57413 | | 225 | – | 616 | 54 | 73 | 36 | 38 | – |
| | | 球足目 | *Ballophilus australiae* | NMCZ:IZ:131549 | SAMN57413 | | 226 | – | 795 | 70 | 24 | 34 | 49 | – |
| | | 大齿目 | *Henia brevis* | NMCZ:IZ:133574 | SAMN57413 | | 227 | – | 502 | 44 | 12 | 86 | 29 | – |
| | 地蜈蚣目 | *Clinopodes flavidus* | T | – | SRR1653181–56 | | 247 | 629 | 439 | – | – | |
| | | *Schendyloides alacer* | NMCZ:IZ:152857 | SAMN57413 | | 228 | – | 370 | 33 | 52 | 16 | 29 | – |
| | | *Stenotaenia linearis* | TMCZ:IZ:133575 | SRR3233208 | – | 458 | 388 | 236 | 36 | – | – |
| | 带足目 | *Himantarium gabrielis* | NMCZ:IZ:131565 | SAMN57413 | | 229 | – | 888 | 73 | 24 | 45 | 51 | – |
| | 线带目 | *Strigamia acuminata* | G | – | – | PRJEB599444 | 774 | 102 | 54 | 33 | – | – |
| | 多带目 | *Tygarrup javanicus* | NMCZ:IZ:133573 | SAMN57413 | | 230 | – | 802 | 71 | 84 | 50 | 54 | – |
| | 管足目 | *Notiphilides grandis* | NMCZ:IZ:133579 | SAMN57413 | | 231 | – | 854 | 75 | 74 | 65 | 54 | – |
| | 扁带目 | *Hydroschendyla submarina* | NMCZ:IZ:32096 | SAMN57413 | | 232 | – | 906 | 74 | 34 | 42 | 47 | |
| | 隐带目 | *Cryptops hortensis* | TMCZ:IZ:130583 | SRR1153457 | – | 368 | 308 | 197 | 25 | – | – |
| | 拟隐带目 | *Mimops orientalis* | T | – | SAMN18321929 | – | 268 | 230 | 136 | 21 | – | – |
| | 隐带目 | *Akmynopellis chilensis* | TMCZ:IZ:30385 | SRR3233156 | – | 523 | 442 | 276 | 31 | – | – |
| | | *Alipes grandidieri* | TMCZ:IZ:130616 | SRR619311 | – | 396 | 343 | 214 | 30 | – | – |
| | | *Rhysida immarginata* | G | – | – | GCA_023313115.1 | 1,047 | 850 | 500 | 53 | – | – |
| | | *Scolopendra cretica* | G | – | – | PRJEB772226 | 763 | 44 | 8 | – | – | – |
| | | *Scolopendropsis bahiensis* | TMCZ:IZ:32736 | SRR3458603 | – | 515 | 434 | 262 | 31 | – | – |
| | | *Newportia adisi* | TMCZ:IZ:130770 | SRR3233034 | – | 507 | 439 | 288 | 35 | – | – |
| | | *Scolopocryptops sexspinosus* | NMCZ:IZ:165596 | SAMN57413 | | 233 | – | 899 | 77 | 94 | 72 | 54 | |
| 倍足纲 | 双节目 | 叶目 | *Lophoproctus lucidus* | NERG508502 | SAMN57413 | | 234 | – | 596 | 486 | 325 | 45 | – |
| | 双节目 | *Eudigraphis taiwaniensis* | NMCZ:IZ:128912 | SAMN57413 | | 235 | – | 475 | 412 | 277 | 38 | | |
| 球目 | 球虫科 | *Cyliosoma* sp. | NMCZ:IZ:44064 | SAMN57413 | | 236 | – | 845 | 708 | 445 | 53 | – | – |
| | 亚球目 | *Procyliosoma* sp. | NMCZ:IZ:133278 | SAMN57413 | | 237 | – | 345 | 314 | 219 | 28 | | |
| 卷倍目 | 卷倍科 | *Glomeris marginata* | TMCZ:IZ:43690 | SRR3233211 | – | 432 | 367 | 235 | 28 | – | – |
| | | *Haploglomeris multistriata* | T | – | SRR3485985–21 | 31771 | 221 | 9 | – | – | – |
| | 卷倍科 | *Glomeridella minima* | T | – | SRR3485983–268 | 2241 | 501 | 6 | | | |
| 大理石目 | 大理石科 | *Glomeridesmus marmoreus* | NMCZ:IZ:169039 | SAMN57413 | | 238 | – | 770 | 669 | 432 | 53 | | |
| 管倍目 | 管倍科 | *Siphonophora* sp. | NMCZ:IZ:165108 | SAMN57413 | | 239 | – | 670 | 596 | 391 | 48 | | |
| 扁节目 | 雄颚科 | *Andrognathus corticarius* | NMCZ:IZ:165599 | SAMN57413 | | 240 | – | 843 | 694 | 431 | 44 | | |
| 多节目 | 多节科 | *Petaserpes* sp. | NMCZ:IZ:167474 | SAMN57413 | | 241 | – | 924 | 761 | 467 | 52 | – | – |
| | 管倍科 | – | TMCZ:IZ:141597 | SRR17085348 | – | 483 | 413 | 265 | 32 | – | – |
| | | *Rhinotus purpureus* | T | – | SRR6767060 | – | 552 | 472 | 288 | 30 | | |
| 隐管倍目 | 隐管倍科 | *Hirudicryptus canariensis* | NERG4639 | SAMN57413 | | 242 | – | 207 | 184 | 125 | 17 | | |
| 美多目 | 腹足科 | *Abacion magnum* | NMCZ:IZ:165592 | SAMN57413 | | 243 | – | 605 | 540 | 8 | – | | |
| | 美多科 | *Callipus foetidissimus* | T | – | SRR3485975–31 | 6269 | 160 | 22 | | | |
| 索足目 | 钳足科 | *Cleidogona* sp. | NMCZ:IZ:165604 | SAMN57413 | | 244 | – | 645 | 840 | 8 | – | | |
| | 索足科 | – | NMCZ:IZ:133239 | SAMN57413 | | 245 | – | 966 | 799 | 479 | 55 | – | – |
| | 板足科 | *Nanogona polydesmoides* | G | – | – | GCA_965153395.1 | 956 | 774 | 483 | 56 | – | – |
| | 异足科 | *Reginaterreuma tarkinensis* | NMCZ:IZ:135141 | SAMN57413 | | 246 | – | 229 | 207 | 144 | 24 | – | – |
| | 扁足科 | *Striaria* sp. | T | – | SRR6767078 | – | 634 | 553 | 338 | 44 | – | – |
| | 毛足科 | *Scoterpes* sp. | T | – | SRR6767065 | – | 473 | 398 | 253 | 27 | | |
| 细足目 | 细足科 | *Prostemmiulus* aff. *modicus* | NMCZ:IZ:162945 | SAMN57413 | | 247 | – | 936 | 810 | 494 | 55 | – | – |
| | | *Prostemmiulus loomisi* | T | – | SRR6767072 | – | 364 | 317 | 182 | 26 | | |
| 管足目 | 管足科 | *Siphoniulus porosus* | NERG3451 | SAMN57413 | | 248 | – | 394 | 346 | 233 | 38 | | |
| 螺旋倍目 | 螺旋倍科 | *Cambala hubrichti* | NMCZ:IZ:165595 | SAMN57413 | | 249 | – | 811 | 693 | 424 | 47 | – | – |
| | 螺旋倍科 | *Orthoporus* sp. | T | – | SRR6767053 | – | 362 | 312 | 181 | 27 | | |
| 螺旋足目 | 粗足科 | *Leptogoniulus sorornus* | NMCZ:IZ:169081 | SAMN57413 | | 250 | – | 1,018 | 864 | 506 | 52 | – | – |
| | 犀倍科 | *Anadenobolus monilicornis* | NMCZ:IZ:169077 | SAMN57413 | | 251 | – | 987 | 844 | 495 | 56 | | |
| 马陆目 | 马陆科 | *Cylindroiulus truncorum* | NMCZ:IZ:165601 | SAMN57413 | | 252 | – | 966 | 795 | 477 | 51 | – | – |
| | 丝足科 | *Orinisobates nigrior* | T | – | SRR6767051 | – | 498 | 427 | 278 | 35 | – | – |
| | 扁足科 | *Californiulus* sp. | T | – | SRR6767073 | – | 347 | 300 | 197 | 25 | – | – |
| | 副马陆科 | *Uroblaniulus* sp. | T | – | SRR6767050 | – | 488 | 418 | 283 | 41 | | |
| 板足目 | 黑足科 | – | NMCZ:IZ:133045 | SAMN57413 | | 253 | – | 940 | 811 | 484 | 54 | – | – |
| | 铁足科 | *Chondrodesmus cairoensis* | T | – | SRR6767075 | – | 162 | 134 | 841 | 5 | – | – |
| | 带足科 | *Pseudoprionopeltis elaphrus* | NMCZ:IZ:29380 | SAMN57413 | | 254 | – | 934 | 798 | 485 | 53 | – | – |
| | 单足科 | *Prosopodesmus* sp. | NMCZ:IZ:129749 | SAMN57413 | | 255 | – | 883 | 770 | 468 | 53 | – | – |
| | 全足科 | – | NMCZ:IZ:125818 | SAMN57413 | | 256 | – | 953 | 826 | 499 | 55 | – | – |
| | 尖足科 | *Oxydesmus* sp. | NMCZ:IZ:133047 | SAMN57413 | | 257 | – | 597 | 525 | 338 | 44 | – | – |
| | 扁足科 | *Oxidus gracilis* | NMCZ:IZ:165600 | SAMN57413 | | 258 | – | 631 | 525 | 334 | 42 | – | – |
| | 板足科 | *Pseudopolydesmus canadiensis* | NMCZ:IZ:165605 | SAMN57413 | | 259 | – | 870 | 725 | 453 | 55 | – | – |
| | 塔足科 | *Myrmecodesmus* sp. | NMCZ:IZ:162923 | SAMN57413 | | 260 | – | 927 | 803 | 474 | 53 | – | – |
| | 球足科 | *Desmonus earlei* | T | – | SRR6767079 | – | 691 | 598 | 377 | 46 | – | – |
| | 异足科 | *Euryurus maculatus* | NMCZ:IZ:165598 | SAMN57413 | | 261 | – | 180 | 165 | 107 | 22 | – | – |
| **外群** | 蛛形纲：蜘蛛目 | 蛛科 | *Argiope brunnichi* | G | – | – | GCA_947563725.1 | 779 | 565 | 353 | 40 | | |
| 弹尾纲：长角亚目 | 跳盲科 | *Cyphoderus albinus* | G | – | – | GCA_965194875.1 | 688 | 513 | 303 | 37 | | |
| 蛛形纲：盲蛛目 | 扁蛛科 | *Leiobunum subalpinum* | G | – | – | GCA_965184155.1 | 981 | 790 | 454 | 51 | | |
| 剑尾纲 | 鲎科 | *Limulus polyphemus* | G | – | – | GCA_000517525.1 | 480 | 306 | 184 | 25 | | |
| 软甲纲：十足目 | 蝉虾科 | *Petrolisthes cinctipes* | G | – | – | GCA_033782935.1 | 662 | 359 | 226 | 34 | | |
| 昆虫纲：直翅目 | 沙螽科 | *Tetrix japonica* | G | – | – | GCA_048165185.1 | 818 | 568 | 359 | 39 | | |

**表2** 本研究所测试样本的标本信息，包括凭证代码和登录信息
来源列：T = 转录组，G = 基因组，N = 新测序UCE标本

我们展示了在PHYLUCE步骤*match_contigs_to_probes*之后原始UCE的数量，以及包含在50p、60p和70p矩阵中的UCE数量。

**在新标签页中打开表格**

**Metazoa与Myriapoda探针集统计**

我们发现，这个新开发的多足类探针在利用现有基因组和转录组进行计算机模拟测试时，在UCE位点恢复方面通常比Metazoa探针集表现更好（图3；表S2）。以下标本中Metazoa探针集恢复率高于多足类探针集：*Nanogona polydesmoides*（倍足纲：索足目）、*Scolopendrellopsis subnuda*（唇足目）、*Strigamia acuminata*（唇足纲：地蜈蚣亚目）和*Scolopendra cretica*（唇足纲：隐带目亚目），其中最后一种物种在多足类探针集下的恢复率显著低于Metazoa探针集（多足类67个位点，Metazoa 1,157个位点）。同样，一些从转录组中提取UCE数据的物种也显示出类似模式，即Metazoa探针集恢复率更高。这些包括*Scutigerella* sp.（唇足目）、*Mimops orientalis*（唇足纲：隐带目亚目）、*Callipus foetidissimus*（倍足纲：美多目）、*Prostemmiulus loomisi*（倍足纲：细足目）和*Chondrodesmus cairoensis*（倍足纲：板足目）。然而，大部分转录组样本标本在新开发的多足类探针集下的位点恢复率高于Metazoa探针集，或恢复率相当（图3；表S2）。

**图3** Metazoa与Myriapoda UCE探针集恢复情况

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使用Metazoa探针集或多足类探针集对基因组和转录组样本的原始UCE位点恢复情况进行比较。点按探针集之间位点恢复数量的差异着色，形状代表各个纲。位于虚线拟合线（红色）上方的点表示多足类探针集恢复率高于Metazoa探针集，反之则在拟合线下方。比Myriapoda恢复率更高的Metazoa分类群已标注，以及*Rhysida immarginata*，该物种的Myriapoda UCE恢复率显著更高。粗轮廓线条的标本为基因组；无轮廓的为转录组。

**系统发育基因组学**

**多足类亲缘关系概述**

在所有分析中，多足类亲缘关系通常都得到了很好的支持（图4）。我们恢复了两种主要拓扑结构；在这两种结构中，各个纲均为单系，但更深层的关系不兼容（图4和S2–S8）。第一种拓扑结构表明多足类是单系的（50p和60p IQ-TREE，50p和60p ExaBayes），其中唇足纲从倍足纲+唇足目+甲壳纲的分支中分出。在这个类群中，甲壳纲+唇足目是倍足纲的姐妹群，因此恢复了Progoneata和Edafopoda两个类群。我们的SeaLion输出结果进一步支持这一拓扑结构，在CDOPS分析中作为最佳支持的结构（图5）。同样，在这项分析（CDOPS）中，SeaLion结果更倾向于DOPS和COPS拓扑结构，倍足纲或唇足纲与P+S（甲壳纲+唇足目）分离的四分法具有最高的支持率（vs. CDOP和CDOS），未过滤的支持值为0.77（COPS）或0.75（DOPS）。然而，四分法之间的支持值差异很小（无论使用未过滤还是"RISK"过滤），未过滤值范围为0.56（CDOP）至0.77（图5；见表S4）。由于在这些系统发育树中恢复了Edafopoda，这些结果否定了基于更高占用率50p和60p矩阵将Progoneata划分为Symphyla + Dignatha（= Pauropoda + Diplopoda）的做法。

**图4** 多足类系统发育树

**显示完整图注** **图查看器**

（A）使用新颖的多足亚门UCE探针集从50p（50%占用率）矩阵中推断的多足类系统发育树，使用IQ-TREE。瓷砖图显示了在50p、60p和70p矩阵下每种分析类型（IQ-TREE、ExaBayes和PhyloBayes）对主要节点的支持情况。此图中的支持指数范围从完全支持到未恢复节点；替代系统发育树可在File S2中找到。带星号的节点表示50p IQ-TREE系统发育树的自举（BS）值，出现在节点未获得完全支持时。（B）70p IQ-TREE、70p ExaBayes和CAT-GTR分析恢复的主要替代拓扑结构。C（橙色）代表唇足纲，D（粉色）代表倍足纲，S（黄色）代表唇足目，P（蓝色）代表甲壳纲，O（灰色）代表外群。从基因组或转录组采样的物种分别用G或T点表示。

**图5** SeaLion四分法结果

**显示完整图注** **图查看器**

SeaLion（PhyQuart）四分法分析结果显示了CDOPS分析的未过滤物种-四分法的三元图。点靠近每个顶点的程度表示在四分法中对给定拓扑结构的支持强度（可能的三种拓扑结构之一）。O=外群，C=唇足纲，D=倍足纲，P=甲壳纲，S=唇足目。中位支持值总结了每个图中的点值，并根据其对拓扑结构的相对支持程度放置。黑色树是SeaLion输出的"最佳根类群树"，总结了单个四分法结果并呈现了最佳的总体系统发育假设。

SeaLion后处理呈现相反的结果，即CDOP和CDOS基本同等支持，其中CDOS略为支持的拓扑结构（对数似然值 = ?11,362,896.28，ΔCDOP = 2.1674e?05，ΔCDOS = 0，pKH of both CDOP and CDOS = 0.5，pSH_CDOS = 0.808，pSH_CDOP = 1，pAU of both CDOP and CDOS = 1（表S5）。这一分析强烈否定了COPS和DOPS拓扑结构，pAU_COPS = 8.18 × 10?7，pAU_DOPS = 5.07 × 10?4（表S5）。

在CAT-GTR分析和70p IQ-TREE及ExaBayes矩阵支持的第二种主要拓扑结构中，甲壳纲始终与外群归为一组——作为泛甲壳类（*Tetrix japonica*、*Cyphoderus albinus*和*Petrolisthes cinctipes*）的姐妹群（图S2–S5和S8）。唇足目则是其余多足类（唇足纲+倍足纲类群）的姐妹群，从而支持了Pectinopoda假说。

**甲壳纲和唇足目**

甲壳类和唇足类的代表个体被归入预期的科中。对于甲壳纲，四角亚目、宽甲壳科和甲壳科的所有成员都如预期般放置——六角亚目是该研究未包含的唯一多足目目。对于唇足目，所有样本无论属于圆唇足科还是有颚唇足科都如预期般放置。在发现甲壳纲和唇足目为姐妹群关系的分析中，这一关系得到了稳健支持。

**倍足纲**

在倍足纲中，包含双节目+球足目的类群是最早分化的谱系，从而使钙化的Chilognatha不再单系。球足目——包括鼠妇目——分为球虫目+大理石目和卷倍目，这表明卷成球形的能力（卷倍目和球虫目）与传统分类学之间存在不一致。"长体"马陆类群Helminthomorpha是单系的，其两个子类群Colobognatha和Eugnatha也是单系的，这与基于形态学的系统发育分析和当前分类学一致。Colobognatha包含管倍目、扁节目、多节目以及隐管倍目。至此，最后这个类群的关系仅在最近才得到确认，与此拓扑结构一致。在所有分析中，多节目均为并系，隐管倍目的*Hirudicryptus canariensis*归入其中，作为*Petaserpes* sp.的姐妹分类群。Colobognatha各目之间的关系与Vasquez-Valverde等人的解析结果一致，管倍目是扁节目+多节目（包括*Hirudicryptus*）的姐妹群。此外，在70p ExaBayes矩阵中，Coelochaeta（美多目+索足目）为复系，*Abacion magnum* + *Callipus foetidissimus*（美多目）作为Juliformia + 板足目的姐妹群——其余Coelochaeta（索足目）是管足目+细足目+美多目+Juliformia+板足目较大类群的姐妹群（图S2和S8）。这些差异可能归因于*Abacion magnum*的位点恢复率较低。虽然Juliformia被确定为单系，但内部关系同样显得不稳定。在CAT-GTR和50p及60p ExaBayes和IQ-TREE分析中，螺旋足目+螺旋倍目被解析为马陆目的姐妹群（图4、S1和S3–S7）。然而，在我们的70p ExaBayes和70p IQ-TREE树中，我们发现螺旋足目是螺旋倍目+马陆目的姐妹群。此外，在板足目内部，*Oxidus gracilis*的位置不稳定（图S2和S8）。鉴于这些目的巨大多样性，我们期望使用此UCE探针集增加分类群采样可能有助于解决这些不一致性。

罕见的管足目在此由最近描述的*Siphoniulus porosus*代表，这是仅存的三个现存管足目物种之一，所有这些物种的标本都极为有限。管足目的位置长期以来尚未确定——之前基于形态学数据的分析将管足目置于Helminthomorpha内一个未解决的谱系中，或在Eugnatha内一个未解决的位置上。在此，管足目是细足目的姐妹群，由两个*Prostemmiulus*物种代表；这一关系在所有分析中都是一致且得到充分支持的，并最近由Vasquez-Valverde等人（图4和S1–S8）进行了确认。包含管足目+细足目的类群一致地被恢复为Juliformia+板足目类群的姐妹群（图4）。然而，Juliformia与板足目之间的分歧以及（Juliformia+板足目）与（管足目+细足目）之间的分歧在非CAT-GTR分析中持续获得较低的支持值（图4、S1和S6–S8）。一些更进化的板足目科之间的关系，包括黑足科、异足科、单足科和尖足科，获得较低的支持且在分析中不稳定（图4和S1–S8），这再次反映了我们的采样可能遗漏了这些目更大的多样性。

**唇足纲**

最不多样的板唇足亚目在所有分析中都是最早分化的谱系，并且是其余唇足纲的姐妹群，这与Benavides等人及传统假说（认为石蜈蚣亚目是其余唇足纲的姐妹群）相反（见图4和S1–S8）。石蜈蚣亚目因此在所有矩阵中呈现为其余三个亚目的姐妹群（图4）。石蜈蚣亚目的内部关系得到了很好的支持，三个现存科（扁石蜈蚣科、石蜈蚣科和石蜈蚣科）及其中的属、种和种内（即*Scutigera coleoptrata*，尽管全球采样但种水平多样性很低）均如预期般恢复（图4）。石蜈蚣科和扁石蜈蚣科的姐妹群关系，排除石蜈蚣科，这在之前的分子系统发育中已确定，基于Sanger测序或转录组学，但与我们的50p和60p IQ-TREE、50p和60p ExaBayes矩阵或50p CAT-GTR矩阵的结果不符，这些矩阵提出石蜈蚣科和扁石蜈蚣科是石蜈蚣科的姐妹群（图4、S1、S3、S6和S7）。传统关系在70p矩阵中恢复（图S2、S5和S8）；然而，60p CAT-GTR矩阵（图S4）最佳支持了一个石蜈蚣科不具单系性的拓扑结构，*Dendrothereua nubila*是*Tachythereua* sp. + 该亚目其余部分的姐妹群。Thereuoneminae在我们所有分析中都是单系的（图4），并反复分为包含*Pilbarascutigera*的谱系和*Allothereua*+*Parascutigera*，以及包含*Thereuonema*+*Thereuopoda*的类群，与之前研究的结果一致。在50p和60p矩阵中，球唇足亚目从地蜈蚣亚目+隐带目亚目（= Epimorpha）中分出，而在70p矩阵中我们确定地蜈蚣亚目与球唇足亚目+隐带目亚目之间存在分歧（图4）。

采样的百足目目科级结构在最近转录组学工作和数据集之间大致一致。然而，我们恢复了一个不具单系性的*Anopsobius*（扁唇足科），*Anopsobius neozelanicus*与*Lithobius forficatus*归为一组，与*Anopsobius giribeti*分开。在隐带目亚目中，*Mimops orientalis*要么恢复为隐带科（Scolopendridae）的姐妹群（即在所有50p和60p矩阵中[**IQ-TREE、ExaBayes**和CAT-GTR]（图4、S1、S3、S4、S6和S7），要么恢复为所有其他隐带目亚目的姐妹群（在所有70p矩阵中）（S2），与Benavides等人一致，也与Taktikospina假说一致。

由于我们的分析缺乏冥王星目（Plutoniumidae）的数据，我们无法全面检验盲肢支（Tykhepoda）的单系性，尽管其两个被采样的科——暗蛛纲科（Cryptopidae）和盲蝎科（Scolopocryptopidae）——在所有分析中都形成了一个支系（图4）。在唇足纲目（Geophilomorpha）中，与唇足纲（Chilopoda）其他谱系相比，终端类群在不同分析之间的位置相对不稳定，包括希曼塔里姆·加布里埃尔（Himantarium gabrielis）、大诺提菲利德斯（Notiphilides grandis）的位置，以及该群内深嵌套的谱系，即唇足类的亨尼亚·布里斯（Henia brevis）、黄林氏螨（Clinopodes flavidus）和狭带螨（Stenotaenia linearis）（图4和S1–S8）。然而，Placodesmata（由节蛛科的爪哇爪哇虫 Tygarrup javanicus 采样）与Adesmata（所有其他唇足纲目成员）之间的基部分裂得到了很好的支持（图4）。

讨论

我们在本文中提出了一套可靠的马陆（Myriapoda）探针组，成功地恢复了该纲内浅层和深层分歧的谱系。与其他探针组相比，该探针组的UCE:探针比例相对较高（约20,000个探针捕获约1,100个UCE，相比之下，其他探针组使用12,000–16,000个探针来捕获相同数量的位点），这反映了用于探针组设计的类群的高度分歧性。与蛛形纲（以及可能的珊瑚虫纲Anthozoa）一起，此处测试的探针组将是最具分歧性的探针组之一，捕获了所有马陆纲目的UCE，而马陆的化石可追溯至志留纪。此外，我们发现与使用相同数据集的Metazoa探针组相比，这一新开发的马陆探针组通常恢复了更高的位点计数。

该工具在重建不同分类水平的关系方面具有实用性，从种内到纲——尽管一些深层分裂与先前的结果相冲突——尤其是在唇足纲内部的深层分裂或节胸目（Polyxenida）相对于五节纲（Pentazonia）的位置方面，无论我们使用串联法（结果已展示）还是基于合并的系谱方法（ASTRAL结果未展示）。尽管该项目的目标并非主要是阐明马陆纲内部的所有关系，而是设计一种在多个分类水平上都有用的工具，但我们恢复了Siphoniulida和Siphonocryptida等神秘类群的位置，并证明这一工具包将对不同尺度的马陆研究者都有用。此外，大多数相互冲突的关系在之前的一些分析中已经被恢复过，因此这些困难可能与该群系的古老年龄有关，而不一定与探针组的有效性有关。

我们在评估的矩阵中观察到的一个主要动态拓扑结果是马陆纲四个纲目之间的关系，这一问题是马陆学研究历史上一直存在的难题。这体现在我们SeaLion四支分析中相互矛盾的结果，恢复了对比鲜明的最佳支持拓扑。尽管如此，我们的分析将这些结果减少为两种主要拓扑（图4）。第一种由50p和60p IQ-TREE、相应的ExaBayes分析以及PhyQuart SeaLion指标中的"最佳树"支持，其拓扑为唇足纲从倍足纲+栉板目+节胸目支系中分化出来。该拓扑同时支持Edafopoda的单系性和Progoneata的假说，正如Regier等人使用核标记所恢复的、Kück等人进行的"过滤"四支分析，以及Szucsich等人使用转录组数据未排除的场景。Edafopoda的大部分支持来自分子数据，尽管Szucsich等人提供了一些潜在的形态学自衍特征。另一种拓扑得出形态学上不合理的结果，即倍足纲与外群聚类，节胸目为唇足纲+倍足纲的姊妹群；该结果约在 половину 的分析中恢复：70p IQ-TREE、70p ExaBayes和CAT-GTR分析（图4及S2、S3–S5和S8），但这可能是70%占有率矩阵中低位点数（40个位点）的反映。尽管如此，我们在此确定了倍足纲的不稳定性。该结果得到了Fernández等人研究结果的印证，即这一位置可能是长枝吸引（LBA）的后果，以及与其他谱系相比所包含的类群数量较少（三个）所致。70p矩阵的结果总体上与其他数据矩阵不太一致，这可能是分析中所包含标记较少的结果，因此表明一些相互冲突的节点可能受益于更大的基因采样。

所有马陆目均为单系，这印证了一项近期研究，该研究将吸卵目（Siphonocryptida）的Siphonocryptus canariensis嵌套在节胸目（Polyzoniida）中，并将同一物种的基因组数据纳入其中。因此，作者建议将原吸卵目降级为节胸目下的一个科，正如之前基于解剖数据所提出的，我们也在此支持这一决定。

倍足纲（Diplopoda）

刚毛目（Polyxenida）中的刚毛马陆与五节纲（包括球马陆目、圆马陆目和龟甲目）聚类是一个出乎意料的拓扑结果，因为刚毛目通常被恢复为倍足纲其余类群的姊妹群，最近也包括Vasquez-Valverde等人。然而，该节点在所有矩阵中一致恢复（图4和S1–S8），在部分转录组分析中也有所发现。尽管刚毛目和五节纲的位点恢复率相对较高，但这一结果可能是采样偏差的产物，以及本文中包含的刚毛目多样性较低所致。此外，我们的分析揭示了五节纲内部的另一个分歧结果，即龟甲目被恢复为龟甲目+球马陆目的姊妹群，这与Vasquez-Valverde等人、Benavides等人以及其他使用多种数据类型的作者相矛盾，他们发现球马陆目为龟甲目+龟甲目的姊妹群。在任何一种情况下，球马陆目和龟甲目共有的卷球能力（即卷曲），很可能如先前所建议的那样是独立进化的，因此我们的结果进一步否定了所谓卷曲类Oniscomorpha的单系性。

在我们分析中，Colobognatha的单系性与众多形态学和行为的自衍特征一致，也与这些目独特的防御分泌物化学成分的日益增长的数据一致，特别是萜烯生物碱的共同存在。这些可能已与Platydesmida和Polyzoniida中的亲代抚育行为共同进化，二者在我们的树中形成一个支系。

Coelochaeta（包括Callipodida + Chordeumatida）是Hoffman采用的分类，在我们分析中获得了不同程度的支持或否定（图4和S1–S8）。Callipodida在此由大腹马（Abacion magnum）和 Callipus foetidissimus 代表，是所有马陆中位点恢复率最低之一，平均原始位点数为188（表2）。Abacion magnum的位点数少于100，但仍被纳入分析，因为在最初的系统发育分析中，该类群与 chordeumatids 一起形成了一个单系的Coelochaeta。然而在一些矩阵中（IQ-TREE 60p，所有ExaBayes以及50p和60p CAT-GTR）（S2），恢复的低位点数可能会混淆该谱系的定位，将Callipodida放置在Juliformia + Polydesmida的支系中。作为Chordeumatida的姊妹群更为直观，并得到一些先前形态学和分子系统发育的支持，但根据我们的结果，其位置不稳定。

Stemmiulida + Siphoniulida的姊妹群关系在我们所有分析中得到了稳健支持（图4和S1–S8），与Vasquez-Valverde等人的近期发现一致。Nematophora，一个由后足腺存在而联合的支系，包括Stemmiulida + Siphoniulida + Callipodida + Chordeumatida，在我们任何分析中均未恢复（图4和S1–S8），这与先前的转录组分析一致，但与已发表的形态学假说相矛盾。然而，这一分类早已被基于形态特征所质疑。后足腺也存在于Polydesmida中，其在倍足纲中可能有独立起源，或在Juliformia中次生丧失。Siphoniulida + Stemmiulida支系要么是Callipodida + Juliformia + Polydesmida的姊妹群（在60p IQ-TREE、ExaBayes以及50p和60p CAT-GTR分析中），要么是Juliformia + Polydesmida的姊妹群（在50p和70p IQTree以及70p CAT-GTR矩阵中）（S2）。

Juliformia和Polydesmida均被恢复为单系，Juliformia目中的Spirobolida、Spirostreptida和Julida亦然（图4）。Spirobolida和Spirostreptida被识别为姊妹群，这也已经在核糖体RNA和线粒体基因组分析中得到恢复。在某些分析中（IQ-TREE 50p和70p，CAT-GTR 70p），Polydesmida + Juliformia为单系，建立了所谓的环形成群，其特征是骨片融合成环。这一形态学假说被其他恢复的拓扑不同程度地否定，后者将Callipodida置于Juliformia的姊妹位置（IQ-TREE 60p，ExaBayes，50p和60p）（图4和S1、S6、S7）。Polydesmida内部关系的不稳定性可能是类群采样偏差的产物，因为这些个体的位点恢复率很高（Polydesmida平均706个位点），但每个受研究的科仅包含一个成员；我们期望随着采样增加，这些多样支系的相对位置将得到澄清，因为我们的UCE探针组在该类群中证明高度成功。

唇足纲（Chilopoda）

我们的结果与典型的蜈蚣分类方案的主要区别在于将Craterostigmomorpha置于最早分化的蜈蚣目。通常，Scutigeromorpha被视为其余目的姊妹群，基于形态学数据、Sanger标记和转录组数据，这与许多形态特征一致，这些特征将非Scutigeromorph/背节目蜈蚣联合为Pleurostigmophora支系。尽管如此，Craterostigmomorpha的位置一直备受争议。它们主要被归入Epimorpha（Edgecombe引用了跨越40年的14项形态学研究）——包含Geophilomorpha + Scolopendromorpha的支系——形成更大的Phylactometria支系。我们的数据反而支持Amalpighiata假说——以Lithobiomorpha而非Craterostigmomorpha作为Epimorphic蜈蚣的姊妹群。该拓扑存在于我们大多数分析中（图4和S1–S8），尽管Craterostigmomorpha和Scutigeromorpha的位置互换了，但Amalpighiata与Szucsich等人以及Benavides等人的转录组结果一致。

Amalpighiata的形态学支持非常稀少，并且被联合Craterostigmus与Epimorpha的特征所矛盾，其中最显著的是卵和幼体的母体护卵行为。Amalpighiata的命名特征指的是缺乏多余的马尔皮氏管，后者仅见于Scutigeromorpha和Craterostigmomorpha，其存在被推断为祖征。然而，附肢自切时首选断裂点（PBP）的位置为Amalpighiata提供了另一种潜在的自衍特征。Maruzzo等人回顾了当时已知的唇足纲数据，得出结论认为基节与转节之间的PBP是Scutigeromorpha、Lithobiomorpha和Scolopendromorpha共有的特征；该特征不适用于Geophilomorpha，后者没有PBP或再生附肢能力的证据。随后发现Craterostigmomorpha与其他具有PBP的唇足纲不同，其PBP位于转节与亚股节之间（见Edgecombe和Giribet图8）。近期对Scutigera coleoptrata腿部"爆炸性再生"的记录否定了Scutigeromorpha的PBP位于基节和转节之间的说法，而是发现其位于转节与亚股节之间，与Craterostigmus相同。在我们UCE树（以及转录组树）上优化后，PBP从唇足纲最后共同祖先的转节-亚股节处转移到了Amalpighiata的基节-转节关节。

在更精细的尺度上，我们发现了Anopsobius和Henicopidae的多系性，Anopsobius giribeti为Anopsobius neozelanicus + Lithobius forficatus的姊妹群。先前Edgecombe和Giribet的分子系统发育研究发现"广泛分布"的A. neozelanicus并非单系，但此处得到的Henicopidae多系性可能是该数据集对Lithobiomorpha采样稀疏的产物（仅Lithobiidae科就包含超过1,000个物种）。这些结果连同本研究中生成的系统发育树，突出了需要重新审视Lithobiomorpha科之间以及科内关系的必要性。

结论

利用新设计的马陆纲UCE探针组，结合跨纲密类群采样，我们重建了涵盖所有纲和几乎所有目的系统发育树。这是迄今最为全面的基因组马陆系统发育，探索了马陆纲内鲜少被采样的类群之间的关系。对于马陆纲纲间关系，我们识别出两种主要拓扑。在其中一种中，倍足纲与泛甲壳类外群相关联——我们认为这是一种人为假象——节胸目为唇足纲+倍足纲的姊妹群。另一种也是首选拓扑是熟悉的Progoneata假说，即唇足纲为倍足纲+节胸目+倍足纲支系的姊妹群；其中，倍足纲与节胸目为姊妹群，符合Edafopoda假说。

本分析进一步证实了此前对倍足类和唇足类等节肢动物系统分类研究所揭示的复杂性，并进一步揭示了目级甚至更精细层次的亲缘关系。尽管如本文所分析的倍足类通用保守元件（UCE）探针集可能在不同分类层次上提供一些非正统的关系——其中最突出的是倍足类基部分支和唇足类基部分支——但在其他使用亚基因组数据的研究中也获得了类似的结果。在此基础上，我们为倍足类学家提供了一套有用的工具包，以便使用UCE技术探讨这一古老而复杂的类群的系统基因组学问题，并通过杂交捕获技术（该技术在博物馆标本中通常能获得良好效果，而这些标本往往难以进行PCR扩增或转录组学和基因组测序）为这一超多样性类群开展更具针对性的分类学和系统学探索开辟了可能。

**研究局限性**
斑蚕类和圆翅目分类群采样不充分，可能促成了各系统发育树之间主要倍足类纲位置的不稳定性。由于本研究主要聚焦于开发一种新型探针集，而非最终确定倍足类主干的亲缘关系，因此某些谱系未能得到最优采样。例如在唇足类目中，我们未能恢复异角蜈蚣科的单系性。我们期望通过对异角目进行更密集的采样（如在本研究中对地蜈蚣目所做的测试），可能纠正这一可能的假象。最后，倍足类基部分支（其中五区类与刷足类合并）和唇足类基部分支（其中穴蜈蚣目为其余唇足类目的姐妹群）的划分差异，可能既反映了这些谱系的古老性，也反映了为这类古老谱系设计UCE探针集的困难——这些谱系由于采样原因（刷足类）或缺乏多样性（穴蜈蚣目）而分类群代表性不足。

**资源可用性**

**主要联系人**
如需获取进一步信息和资源，请联系主要联系人 Lily Shapiro（[e-mail]）。

**材料可用性**
新设计的倍足类探针集由 Daicel Arbor Biosciences（美国密歇根州）商业提供。

**数据与代码可用性**
- 原始序列数据已提交至序列读取档案馆（SRA），可通过BioProject GenBank：PRJNA1456603访问。数据在发表时已公开可获取。
- 组装结果、数据矩阵和contig文件可在哈佛大学数据天地（Harvard Dataverse）获取，网址为 https://doi.org/10.7910/DVN/KT2TV9。数据在发表时已公开可获取。
- 本文分析的是已有的公开可获取数据，可通过SRA和欧洲核苷酸档案馆（ENA）访问；登录号在STAR方法中提供。

**致谢**
感谢哈佛大学比较动物学博物馆无脊椎动物学部门的 Adam Baldinger 及其他成员对本研究所使用标本的组织与馆藏支持。我们同样感谢 Arbor Biosciences 就倍足类探针集开发事宜进行的讨论。计算工作由哈佛大学生理学系科学研究计算组支持的Cannon集群完成。本研究由Wetmore Colles基金资助。

我们特别感谢 Ella Frigyik、Arianna Lord、Kaylin Chong 和 Willians Porto 在运行本研究所需的各种程序方面提供的协助以及给出的有益反馈。学术编辑 Debottam Bhattacharjee 和两位匿名审稿人提供了建设性的批评意见，帮助改进了本文。我们将本文献给我们尊敬的同事 Petra Sierwald，她在本文完成期间离开了我们，过去二十年她一直积极推动倍足类学的发展。

**作者贡献**
概念设计：G.G.、P.R.-F. 和 S.D.；方法学：L.S.、P.R.-F. 和 S.D.；调查研究：L.S.、P.R.-F.、S.D. 和 G.G.；初稿撰写：L.S.；审阅与修改：L.S.、P.R.-F.、S.D.、G.D.E.、E.R. 和 L.R.B.；经费获取：G.G.；资源：G.G.、P.R.-F. 和 E.R.；指导：G.G.

**利益冲突声明**
作者声明不存在竞争性利益冲突。

**生成式AI及AI辅助技术在稿件准备过程中的声明**
在本文准备过程中，作者使用ChatGPT对绘制图5的代码进行了优化。在使用该工具/服务后，作者对内容进行了审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|-----------|------|--------|
| 生物样本 | 哈佛大学比较动物学博物馆和Ernesto Recuero | MCZ:IZ:Accession # 或 ERG: Accession #，见表2 |
| 已提交数据 | 可从NCBI获取原始数据 | 本研究 GenBank: PRJNA1456603 |
| 倍足类基因组和转录组 | 欧洲核苷酸档案馆和序列读取档案馆 | 见表1 |

| 软件和算法 | 来源 | 标识符 |
|-----------|------|--------|
| PHYLUCE pipeline v. 1.7.1 | Faircloth | https://phyluce.readthedocs.io/en/latest/ |
| ART | Huang et al. | http://www.niehs.nih.gov/research/resources/software/art |
| Stampy | Lunter和Goodson | https://www.chg.ox.ac.uk/project-stampy |
| Illumiprocessor | Faircloth | https://illumiprocessor.readthedocs.io/en/latest/ |
| SPAdes v. 3.15.5 | Bankevich et al. | https://github.com/ablab/spades |
| MAFFT | Katoh | https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html |
| gblocks | Castresana et al. | https://home.cc.umanitoba.ca/~psgendb/doc/Castresana/Gblocks_documentation.html |
| CIAlign | Turmescheit et al. | https://github.com/KatyBrown/CIAlign |
| rcorrector | Song和Florea | https://github.com/mourisl/Rcorrector |
| Trim Galore! v. 0.6.10 | Krueger | https://github.com/felixkrueger/trimgalore |
| Bowtie2 v. 2.5.4 | Langdon | https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml |
| Trinity v. 2.15.2 | Grabherr et al. | https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki |
| CDHIT v. 4.8.1 | Fu et al. | https://www.bioinformatics.org/cd-hit/ |
| ucsc-tools | Kuhn et al. | https://genome.ucsc.edu/util.html |
| PhyKit | Steenwyk et al. | https://jlsteenwyk.com/PhyKIT/ |
| IQTREE2 v. 2.2.2 | Minh et al. | https://github.com/iqtree/iqtree2 |
| IQTREE3 v. 3.1.2 | Wong et al. | https://github.com/iqtree/iqtree3 |
| ExaBayes v. 1.5.1 | Aberer et al. | https://github.com/aberer/exabayes |
| PhyloBayes MPI | Lartillot et al. | https://www.phylo.org/tools/pb_mpi/Manual1.4.pdf |
| PhyQuart中的SeaLion算法 | Kück et al. | https://github.com/PatrickKueck/SeaLion/blob/main/SeaLion_Manual.pdf |
| FigTree v. 1.4.4 | Rambaut | https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ |

| 其他 | 来源 | 标识符 |
|------|------|--------|
| 倍足类探针集v1 | 本研究 | Harvard Dataverse [子集] |
| Metazoa探针集v1 | Derkarabetian et al. | https://doi.org/10.7910/DVN/TAIBRW |

**实验模型与受试者细节**
因本研究不涉及生物模型，故省略。

**方法细节**

**探针集设计与计算机模拟测试**
为设计倍足类通用探针集，我们选择了*Strigamia maritima*（地蜈蚣目）的基因组作为基础基因组，因为在设计时该基因组是当时最完整的倍足类基因组（BUSCO得分>93%）。我们进一步纳入了七个额外的可用基因组，代表主要的唇足类和倍足类谱系，以及圆翅目和斑蚕目的转录组，从而覆盖了倍足类的所有主要纲（表1）。使用PHYLUCE pipeline v1.7.1，按照Faircloth所描述的工作流程（https://phyluce.readthedocs.io/en/latest/tutorials/tutorial-4.html）并结合近期文章的优化方法，识别UCE位点并设计诱饵。

首先将所有基因组组装结果从FASTA格式转换为2bit格式。为标准化各分类群之间的位点发现过程，我们使用ART从每个基因组模拟Illumina双端reads。模拟参数如下：reads长度为100 bp，覆盖度为2×，平均片段长度为200 bp，标准差为150 bp，无测序错误。随后使用Stampy将reads比对至基础基因组以识别同源区域，替代率为0.05，以鉴定分类群之间共享的保守区域。将比对后的reads进行过滤、转换为BED格式、合并、筛选去除重复区域和短位点，并存储在SQLite数据库中。使用PHYLUCE在各分类群间鉴定保守位点，并过滤保留存在于至少80%采样分类群中的位点。从基础基因组设计临时诱饵，探针长度120 bp，填充密度3×，随后去除重复和低质量探针。最终探针集由在各分类群中一致恢复的位点生成，产生了一套靶向倍足类保守UCE区域的诱饵集合。

我们使用包含74个样本的数据集（表1；表S1）对最终探针集进行了计算机模拟测试。该数据集包括用于探针设计的基因组和转录组，并纳入*Phalangium opilio*（蛛形纲：盲蛛目）作为外类群。计算机模拟验证后，探针被送往Daicel Arbor Biosciences（美国密歇根州）进行合成。

**合成探针集测试**

**分类群采样**
分类群的选取旨在最大化比较动物学博物馆（MCZ）中可用的倍足类多样性范围（表2）。本研究中新提取的材料被标记为"新鲜"材料，采集于2000年之后，保存在?20°C的95%乙醇中。此外，DNA样本来自MCZ冷冻收藏或从非MCZ标本中直接获取，最终数据集涵盖的采集年份从1995年到2024年。我们的采样涵盖了24个倍足类目中的23个目（圆翅目分为两个科，但未赋予目级分类阶元，因此尽管两个科均有所代表，我们在目数统计中排除了圆翅目），仅缺少单型目六角蚕目（斑蚕目，*Millotauropus*）（表2）。我们的采样包括管隐虫目，该目由Shelley建立，但最近被发现嵌套于多足虫目中（Vasquez-Valverde et al., 在印），如之前基于形态学所推测，代表种为*Hirudicryptus canariensis*（图1E）。我们还包括*Siphoniulus porosus*，由Recuero等人近期描述，这是系统发育上较为神秘的管虫目中仅有三个现生种之一。

在唇足类中，我们的分类群集通过地蜈蚣目成员进行了丰富，以在较浅的分类层次上测试探针集性能，这得益于MCZ中拥有大量保存完好的地蜈蚣目标本，来自不同地理区域，涵盖地蜈蚣目的三个科：地蜈蚣科（Pselliodidae）、石蜈蚣科（Scutigeridae）和地螫科（Scutigerinidae），每科均有多个物种。我们还纳入了多个*Scutigera coleoptrata*（多足蜈蚣，一种全球分布、常与人类共处的物种）个体，以测试探针集对更细微遗传差异的敏感性。我们还特别提及了纳入穴蜈蚣目（Craterostigmormorpha），这是多样性最低的唇足类目，仅包含*Craterostigmus*属的两个种，其中*Craterostigmus crabilli*为本研究中新测序。

为补充我们新鲜提取的材料，我们用公开可获取的资源补充了数据集，包括11个已组装的倍足类基因组和30个转录组（表2）。外类群由其他节肢动物的全基因组代表：泛甲壳类（*Cyphoderus albinus*、*Petrolisthes cinctipes*、*Tetrix japonica*）和蛛形纲（*Leiobunum subalpinum*、*Argiope bruennichi*、*Limulus polyphemus*）。

**体外杂交捕获**
从63个标本的组织中提取组织，通常取单条腿（优先）或身体中段体节，具体取决于生物体大小。"新鲜"标本的基因组DNA使用Qiagen DNeasy提取试剂盒（Qiagen, Valencia CA）获取，遵循制造商的指南。UCE文库制备遵循Starrett等人的靶向富集和序列捕获方案，使用KAPA HyperPrep试剂盒（Roche Sequencing），扩增18个循环。杂交捕获使用Arbor Biosciences试剂盒，采用Faircloth设计并由Starrett等人试用的方法。杂交遵循"myBaits"方案（https://arborbiosci.com/wp-content/uploads/2020/08/myBaits_v5.0_Manual.pdf）。文库杂交24小时，15 μL文库再次扩增，按照Frigyik等人的方案，扩增18个循环。提取、文库制备和杂交步骤中的DNA浓度使用Qubit荧光计（ThermoFischer Scientific）测定。Agilent Tape Station 4200用于确定序列摩尔浓度和片段分布。测序由哈佛大学Bauer核心设施在Illumina NovaSeq S4通道（2024年4月前）或Illumina NovaSeq X（2024年4月起）上完成，读取长度为150 bp双端reads，每个样本目标至少200万reads。

**计算机模拟杂交捕获**
对于我们的新测序样本，首先使用Illumiprocessor（Trimmomatic的封装器）对原始reads进行初始接头去除和质量控制。随后使用SPAdes v. 3.15.5进行组装。使用PHYLUCE 1.7.2进行reads处理、contig匹配和最终位点矩阵构建。在PHYLUCE中，我们使用"phyluce_match_contigs_to_probes"功能将组装的contigs与倍足类探针集fasta文件进行匹配，最低一致性和覆盖度值均为65。使用MAFFT对序列进行比对，随后使用gblocks去除分歧区域，采用中等阈值设置：--b1 0.5 --b2 0.5 --b3 6 --b4 6。使用CIAlign程序去除一致性低于60%的序列和低于阈值质量的区域。

除了我们从组织样本中生成的序列外，我们还从序列读取档案馆（SRA）检索了现有的转录组和基因组序列（SRA：表2）。对于转录组reads，使用rcorrector和Trim Galore! v0.6.10分别进行测序错误校正和接头去除及质量控制，使用Bowtie2 v. 2.5.4过滤rRNA序列数据，使用Trinity v. 2.15.2进行转录组组装。使用CD-HIT v. 4.8.1程序进行相似核苷酸序列的聚类比对和去冗余，参数为-c 0.95 -G 1 -T 8 -M 0。清理后的转录组输入标准的PHYLUCE UCE流程，首先使用"phyluce_match_contigs_to_probes"与倍足类探针集进行匹配。

对于已组装并可供使用的基因组，我们使用Faircloth在"教程III：从基因组中收割UCE位点"中概述的流程。原始fastq基因组文件首先使用ucsc-tools中的faToTwoBit转换为2bit格式。随后使用"phyluce_probe_run_multiple_lastzs_sqlite"将探针与基因组进行匹配，并使用"phyluce_probe_slice_from_genomes"从匹配结果中提取fasta数据。标准PHYLUCE流程使用"phyluce_match_contigs_to_probes"与匹配的基因组contigs继续进行。

**数据矩阵**
我们使用"phyluce_align_get_only_loci_with_min_taxa"命令，基于包含位点的百分比构建了50p、60p和70p占有率矩阵，然后使用"phyluce_align_concatenate_alignments"分别对每个矩阵进行串联。矩阵使用新提取和测序的标本、转录组和基因组的完整数据集构建。此外，将公开可用的基因组和转录组与新开发的Metazoa探针集进行测试，以进行位点恢复的直接比较。

与使用多足类探针集运行'phyluce_match_contigs_to_probes'不同，我们替换为后生动物探针集。该流水线步骤生成的日志文件中恢复了位点计数，但我们未对后生动物匹配文件构建矩阵或进行系统发育分析。使用PHYLUCE命令phyluce_align_get_smilograms_from_alignments构建Smilogram以可视化碱基频率变化，并在R中作图。我们使用PhyKit程序计算GC含量、长度和简约信息位点，方法同Sato等人。系统发育重建 对于我们的最大似然分析，我们使用IQ-TREE2 v. 2.2.2运行，采用1000次超快速自举，并使用PartitionFinder通过松弛层次聚类算法确定的最佳分区方案。我们使用ExaBayes v. 1.5.1和PhyloBayes MPI进行贝叶斯推断。在ExaBayes中，我们在GTR-GAMMA模型下运行两次分析，每条链至少运行3,000,000代；收敛性通过Tracer 1.7.2进行评估（所有贝叶斯分析的ESS值要求超过200）。除了ExaBayes外，我们在PhyloBayes中实现了CAT-GTR模型。CAT-GTR（以及标准CAT模型）已被证明能更好地考虑不同类群间的速率异质性，存在长枝吸引的情况，如后生动物中，以及我们分类学多样化的数据集中。然而，该方法也受到批评，认为其在考虑异质性方面与传统矩阵分区方法相似，但计算量大得多。所有矩阵（50p、60p、70p）均在最大似然和贝叶斯推断框架下进行分析。所得系统发育树使用FigTree v. 1.4.4进行可视化，图形在Adobe Illustrator中制作。我们还测试了PhyQuart中新开发的SeaLion算法，该算法采用四分体采样方法过滤数据，以减少谱系依赖速率异质性导致的冲突信号。Kück等人指出，该程序专为解决多足类中的冲突而设计，可帮助确定高级拓扑结构并解决该类群的分类学冲突，在此类传统方法（如最大似然和贝叶斯推断）产生不一致结果的情况下尤为有用。我们评估了六个单个四分体的树拓扑，每个四分体包含一个内群和一个指定为以下名称的外群：唇足纲、倍足纲、弹尾纲、圆口纲和外群。测试的四分体为：CDOS、CDOP、DOPS和COPS，在未过滤数据集以及使用RISK过滤器对CIAlign处理后的比对fasta数据文件进行处理时进行。输出结果通过R作图进行可视化。在每个四分体中运行SeaLion算法后，我们使用每个四分体输出的最佳支持拓扑作为输入，运行IQ-TREE v. 3.1.2进行拓扑测试，使用50p比对文件进行10000次重复，并采用多种统计参数，包括对数似然值、Shimodaira-Hasegawa检验、Kishino-Hasegawa检验和近似无偏检验。受限输入树如下：CDOP.constraint [({O},({C},({D},{P})))], CDOS.constraint [({O},({C},({D},{S})))], COPS.constraint [({O},({C},({P},{S})))], DOPS.constraint [({O},({D},({P},{S})))]。将受限的背骨系统发育树合并到单个'hypothesis.tre'文件中计算拓扑统计量。然后比较各检验的P值输出和ΔL值。定量与统计分析 关于统计分析的具体细节可在方法细节部分的正文中，或嵌入正文的图表说明中找到。关键资源表列出了本研究中使用的关键检验和程序引用。补充信息 下载全部PDF（3.62 MB）文档S1. 图S1-S8和表S1、S2、S4、S5 电子表格（19.19 KB）表S3. 所有标本match_contigs_to_probes后的FASTA文件统计