《Agriculture》：Synergistic Addition of Biochar and Gypsum Improves Compost Quality from Canteen Food Waste and Chinese Medicine Residues by Reshaping Microbial Networks and the Physicochemical Environment
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本研究旨在通过表型和分子分析鉴定并表征引起菠菜叶斑病的细菌病原。在NSA上分离获得大量形态一致的类Pseudomonas菌落，并从中选取12株代表性分离株用于进一步鉴定。所有分离株在受控条件下接种菠菜植株和叶片均引起病害症状。LOPAT（L—levan pro
本研究旨在通过表型和分子分析鉴定并表征引起菠菜叶斑病的细菌病原。在NSA上分离获得大量形态一致的类Pseudomonas菌落，并从中选取12株代表性分离株用于进一步鉴定。所有分离株在受控条件下接种菠菜植株和叶片均引起病害症状。LOPAT（L—levan production，O—oxidase，P—potato soft rot，A—arginine dihydrolase，T—hypersensitivity reaction）试验结果表明，这些菠菜分离株不能归入任何已描述的荧光Pseudomonas群。基于gltA、gapA、gyrB和rpoD基因的多基因序列分析（MLSA），这些菠菜分离株被归入广P. fluorescens复合群（Pseudomonas fluorescens species complex）内的不同系统发育谱系。9株分离株（SP12、SP21、SP22、SP31、SP32、SP33、SP34、SPR1、SPR4）形成核心支（Group I），与未分类Pseudomonas sp.参考株聚类，而SP14和SP24形成通向该组的、支持良好的基部支。分离株SPR3代表一个早期分化谱系，位于P. marginalis参考群与其余菠菜分离株之间。这些发现提供了塞尔维亚与菠菜叶斑病相关的Pseudomonas菌株的首次表征，并证明该寄主上P. fluorescens复合群内存在多样性，尽管确定性种级鉴定仍需全基因组测序。宿主范围评估显示，供试寄主类型间AUDPC（area under the disease progress curve，病情进展曲线下面积）值存在显著差异（Holm校正p < 0.01）。甜菜表现出最高病害强度，其次为糖甜菜，而瑞士甜菜在实验条件下表现出最低病害强度。这些发现表明与菠菜相关的Pseudomonas种群具有相当大的多样性，并且是塞尔维亚（Vojvodina）首次报道属于P. fluorescens复合群的菠菜相关菌株，此前该地区尚未开展或报道此类研究。
研究背景与目的：菠菜（Spinacia oleracea L.）是重要叶菜，叶片含黄酮类等活性成分，并富含维生素A、C、K及镁、锰、叶酸和铁等。病害是菠菜生产的重要限制因素，影响产量和产品品质；其中真菌和病毒病害被认为经济重要性最高。菠菜细菌病害方面，已报道由Pseudomonas syringae pv. spinaciae引起的细菌性叶斑病和由Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum引起的细菌性软腐病。意大利在20世纪80年代末由Bazzi等首次对菠菜细菌病害进行较系统研究，将其归因于非荧光P. syringae van Hall；Wechter等报道美国South Carolina由Pseudomonas sp.引起的严重细菌性叶斑病，导致该州主要菠菜生产者在2014年停止大规模生产；Koike等报道California由非荧光P. syringae引起的菠菜细菌性叶斑病。Babi?和Watada研究表明，菠菜叶可携带高群体细菌，其中以Pseudomonas等果胶分解菌为主，是新鲜切叶菜冷藏期间细菌性软腐的主要腐败菌。总体而言，除已知病原外，对影响菠菜生产的其他细菌病原认识仍有限。塞尔维亚菠菜既在家庭菜园种植，也进行露地生产用于工业加工；官方统计未单列其年产量。该国菠菜最重要病害被认为是Peronospora effusa引起的霜霉病，而细菌病害研究不充分。此前塞尔维亚已在胡萝卜、欧芹、欧洲防风、甜菜、糖甜菜、油南瓜及核果等作物上报道由Pseudomonas spp.引起的细菌性叶斑病。由于P. syringae复合群分类复杂，准确鉴定植物病原Pseudomonas需采用合适分子方法。因此，本研究旨在鉴定并遗传表征采自塞尔维亚病叶的Pseudomonas分离株，以更好理解其关系及对菠菜生产的影响。
研究人员开展的研究、结论与意义：2021年秋季，研究人员在塞尔维亚Vojvodina的Titel地区品种Matador菠菜上观察到水浸状、不规则叶斑，采集5份症状叶样品，每份3片叶，经分离纯化获得12株代表性分离株。通过表型生化、LOPAT、致病性、宿主范围评估及四基因MLSA，研究人员发现这些分离株属于广P. fluorescens复合群内的多个系统发育谱系，表型上分为两个LOPAT群；所有分离株对菠菜具致病性，SP33致病最重；宿主范围在甜菜、糖甜菜和瑞士甜菜间差异显著。研究首次确认塞尔维亚菠菜细菌性叶斑病由属于广P. fluorescens复合群的细菌分离株引起，并提示与菠菜相关的细菌病原多样性高于此前认识；同时表明LOPAT表型不能可靠用于种级鉴定，确定性种级归属仍需WGS。
关键技术方法：样本来自2021年秋季塞尔维亚Titel（Vojvodina）品种Matador症状菠菜叶5份，每份3叶，经表面消毒和组织浸提后于含蔗糖营养琼脂（NSA）分离纯化，获12株代表性分离株。采用表型生化与LOPAT试验；以针刺注射接种3周龄和成熟菠菜叶进行致病性测定并再分离验证；以甜菜、瑞士甜菜和糖甜菜离体叶进行喷雾和针穿刺接种，按1–6级病斑量表计算AUDPC，并用分层置换检验及Holm校正比较寄主类型；对gltA、gapA、gyrB和rpoD进行MLSA，构建最大似然树（Kimura 2-parameter，1000次bootstrap）。
研究结果：
3.1 表型特征（Phenotypic Characterization）：通过NSA分离、表型生化及LOPAT试验，获得白色、黏液状、凸起、有光泽和leven阳性的优势菌落；所有分离株为革兰阴性、触酶阳性、在King B培养基上产生荧光色素并呈氧化型葡萄糖代谢。LOPAT将分离株分为两组：SP12、SP21、SP22、SP31、SP32、SP33、SP34、SPR1、SPR4为（+??++），SP14、SP24、SPR3为（+?+++）。所有分离株均利用乳酸，仅SPR1、SPR3和SPR4七叶苷水解阳性。结论是这些荧光Pseudomonas分离株具有表型异质性，不能归入已描述的Pseudomonas LOPAT群。
3.1.1 致病性（Pathogenicity）：通过针刺注射法接种3周龄菠菜幼苗和成熟叶片，接种后4天出现水浸状病斑，随后病斑扩展至叶柄并导致植株萎蔫和失去膨压，7天后植株腐烂；所有分离株对菠菜均具致病性，其中SP33症状最明显。再分离菌株的LOPAT结果和gyrB基因部分序列与原分离株一致，支持致病性验证。
3.1.2 宿主范围评估（Host Range Assessment）：通过甜菜、瑞士甜菜和糖甜菜离体叶的喷雾及针穿刺接种、1–6级病斑量表和AUDPC分析，喷雾法下甜菜最感病，所有分离株均可在甜菜上引起较高AUDPC，SP33最高达324.33；瑞士甜菜无症状（AUDPC=0）；糖甜菜仅SP12、SP31和SP33引起有限病害，AUDPC分别为23.04、25.37和28.00。针穿刺法下甜菜仍最感病，SP33的AUDPC为564.08，SP31为556.80，SP12为542.20；瑞士甜菜几乎无症状，仅SP12、SP31和SP33引起轻微反应；糖甜菜病害较轻，SP33为51.91、SP31为36.39、SP12为30.33。总体AUDPC为甜菜354.93±152.86、糖甜菜16.25±19.87、瑞士甜菜2.01±5.30；分层置换检验显示寄主类型间差异显著（p < 0.01），Holm校正后甜菜与糖甜菜、甜菜与瑞士甜菜、糖甜菜与瑞士甜菜间均显著（校正p < 0.01）。结论是供试寄主类型间病害发展存在统计学显著差异，甜菜最感病，瑞士甜菜最不感病。
3.2 多基因序列分析（MLSA）的遗传鉴定：通过对gltA、gapA、gyrB和rpoD四基因串联序列（2152 nt）进行最大似然系统发育分析，12株菠菜分离株被解析为广P. fluorescens复合群内的不同亚支，并与P. viridiflava CFBP1590及P. syringae pathovars明确分开（100% bootstrap支持）。核心支Group I由9株（SP12、SP21、SP22、SP31、SP32、SP33、SP34、SPR1、SPR4）组成，与未分类参考株Pseudomonas sp. KT_2_4、FP1911和CFSAN084952紧密聚类，内部bootstrap支持为61–99%；SP24和SP14形成支持良好的连续基部支（分别为100%和99% bootstrap支持）；SPR3形成独立早期分化谱系（100% bootstrap支持），位于P. marginalis参考群（DR4PS3、PS92、SBW25；100% bootstrap支持）与其余11株菠菜分离株之间。结论是菠菜相关Pseudomonas在P. fluorescens复合群内具有遗传多样性，且LOPAT表型与系统发育关系并不严格对应。
讨论与结论：讨论部分总结认为，塞尔维亚菠菜细菌病害研究很少，全球相关研究亦有限，因此本研究对当地菠菜生产具有重要意义。美国东南部近期研究表明菠菜和Brassica叶菜细菌性叶斑病病因较以往认识更复杂，原先归因于P. cannabina pv. alisalensis的病害被证明由P. capsici引起。本研究首次在塞尔维亚有限地区（Titel，Vojvodina）表征与菠菜相关的植物病原细菌。常规表型测试将分离株分为两个LOPAT群，但不能归入已描述的Pseudomonas LOPAT群；仅SPR1、SPR3和SPR4七叶苷水解阳性，这种差异应解释为表型变异而非独立物种证据。AUDPC在寄主类型间差异显著，甜菜AUDPC明显高于糖甜菜和瑞士甜菜，提示病害发展存在寄主依赖性差异，但该结果应置于离体叶试验背景下解释，不能直接视为田间抗性证据。所有分离株对菠菜幼株和成熟离体叶均具高致病性，SP33症状最重；宿主范围评估显示分离株间寄主专化性和毒力存在明显变异，但未观察到毒力模式与表型或系统发育分组之间的清晰关联。MLSA较16S rRNA基因测序对Pseudomonas具有更高分类分辨率；核心群中成对分离株分支极短且聚类紧密，提示基因序列高度保守并可能来自相似环境；SPR3的位置需谨慎解释，四基因MLSA不能替代全基因组指标。研究结论（译）：基于所得结果，表型和分子鉴定方法首次证实，塞尔维亚菠菜细菌性叶斑病由属于广P. fluorescens复合群的细菌分离株引起。此外，检测到两组病原表明存在与菠菜相关的更广泛细菌病原谱，证实影响该作物的细菌病害多样性高于此前认识。为明确这些核心分离株是广Pseudomonas复合群内的新种还是已描述的分类群，未来结合WGS（whole-genome sequencing，全基因组测序）的研究将提供更全面、可靠的认识，以阐明Pseudomonas菠菜分离株的遗传多样性、分类关系和进化位置；其中可结合ANI（average nucleotide identity，平均核苷酸一致性）和dDDH（digital DNA–DNA hybridization，数字DNA-DNA杂交）进行种级界定。
