配体及纳米抗体介导的标签靶向蛋白降解（tTPD）系统：设计、机制与靶点验证应用

《Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry》：Recent advances in the development of tag-targeted protein degradation systems

　　

靶向蛋白降解（TPD）已成为调节蛋白丰度和探索治疗靶点的重要策略。然而，对于许多候选靶点，缺乏合适的小分子配体（small-molecule ligands）使得在开发靶标特异性降解剂（target-specific degraders）之前，难以评估其可降解性及蛋白耗竭（protein depletion）的生物学后果。标签靶向蛋白降解（tTPD）通过将特定标签引入目标蛋白（protein of interest, POI），并利用标签导向的降解系统实现受控的蛋白耗竭，提供了一种替代性策略。过去二十年中，研究人员开发了多种基于配体（ligand-based）和基于纳米抗体（nanobody-based）的tTPD系统，用于蛋白功能研究和靶点验证（target validation）。本综述总结迄今报道的主要tTPD系统，重点讨论其设计、降解机制、代表性应用、优势及局限性。研究人员进一步讨论适宜tTPD系统的选择、开发新型tTPD工具的可能策略以及拓展其应用的机会。

引言
靶向蛋白降解（TPD）是一种新兴的细胞蛋白水平扰动系统，通常利用泛素-蛋白酶体系统（UPS）或内体/自噬-溶酶体系统实现目标蛋白降解。UPS通过E1、E2和E3酶级联反应形成多泛素链，并由26S蛋白酶体识别降解；溶酶体则通过内体、吞噬体或自噬体融合完成物质降解与回收。依据靶蛋白定位，TPD可分为细胞内靶向蛋白降解（iTPD）和细胞外靶向蛋白降解（eTPD）。iTPD主要包括蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）和分子胶等，eTPD包括溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）、抗体型PROTAC（AbTAC）、蛋白水解靶向抗体（PROTAB）和细胞因子受体靶向嵌合体（KineTAC）等。PROTAC为双功能小分子，一端结合靶蛋白、另一端招募E3泛素连接酶，形成三元复合物并促进靶蛋白泛素化及蛋白酶体降解。tTPD作为TPD系统开发中的重要靶点验证工具，通过CRISPR-Cas9等技术将特定标签与目标蛋白（POI）融合表达，再利用针对标签的降解剂或其他双功能分子实现标签-靶蛋白复合物的泛素化与蛋白酶体降解；不依赖“标签”技术的Trim-Away等不在本文讨论范围。

基于配体的tTPD系统
基于配体的tTPD系统利用小分子配体介导底物降解，已发展出HaloTag、FKBP12^F36V、BromoTag和锌指（ZF）degron等工程化标签。此类标签可分为仅介导底物降解的标准标签，以及将降解活性与荧光或化学发光报告系统偶联的发光型标签，后者可实现对靶蛋白消除过程的可视化监测。

标准标签
标准标签主要包括HaloTag、FKBP12^F36V、BromoTag和ZF标签，其核心功能是介导POI蛋白酶解。研究人员开发了同时结合标签并招募VHL、CRBN或IAP等E3泛素连接酶的异双功能小分子或分子胶，从而实现POI的快速药理学耗竭。

HaloTag
HaloTag为来源于修饰细菌卤代烷脱卤酶的33 kDa工程蛋白标签，可与合成卤代烷配体共价结合，广泛用于蛋白标记、活细胞成像和蛋白纯化。研究人员将疏水标签引入HaloTag平台，以金刚烷为疏水部分、经聚乙二醇（PEG）连接卤代烷配体，构建HyT-13等双功能降解剂，通过蛋白质量控制识别及蛋白酶体途径清除POI；后续HyT-36针对HaloTag7优化。由于疏水标签机制尚不完全清楚且降解效率有限，HaloPROTAC系统被开发出来：HaloPROTAC-3由卤代烷配体、PEG连接子和VHL招募部分组成，可空间桥接E3连接酶与HaloTag7融合POI，诱导UPS依赖降解；HaloPROTAC-E进一步优化VHL结合配体，并用于CRISPR/Cas9基因组整合HaloTag后的内源SGK3、VPS34降解验证。HaloPROTAC技术兼容的E3连接酶已扩展至IAP和CRBN。HaloTag系统应用潜力显著且商业化框架完善，但HaloPROTAC与HaloTag的共价结合可能削弱PROTAC亚化学计量修饰即可降解蛋白的优势，使其难以在系统中循环使用，需化学计量修饰并带来毒性担忧。

FKBP12^F36V-dTAG
FKBP12为可结合FK506、雷帕霉素等免疫抑制药物的12 kDa免疫亲和蛋白。FKBP12^F36V工程变体形成可被AP1867等工程化配体特异性识别的空腔，而野生型FKBP12对该类配体亲和力很弱。dTAG系统以FKBP12^F36V为标签，通过CRISPR-Cas9或慢病毒系统将标签融合至POI，并将AP1867或ortho-AP1867经不同长度连接子与CRBN配体相连，构建dTAG-13、dTAG-48等降解剂；双荧光素酶和Western blot实验验证了其对FKBP12^F36V的选择性和高降解活性，并实现内源敲入FKBP12^F36V-BRD4的降解而不影响BRD2、BRD3。dTAG系统已扩展至HDAC1、MYC、EZH2、PLK1和KRAS^G12V等POI，并在小鼠体内发挥作用；dTAGV-1为招募VHL的第二代dTAG分子，在CRBN型dTAG难以降解的蛋白及体内降解中具有独特优势。dTAG系统已广泛用于蛋白功能和靶点验证，例如ENL、SPT5及去泛素化酶（DUBs）等研究，成为强有力的蛋白控制策略。

BromoTag
BromoTag系统利用BRD4中约15 kDa的工程化溴结构域作为标签。研究人员通过“bump-and-hole”策略在BRD4 BD2溴结构域引入L387A突变形成空腔，使特定配体可识别该突变而不影响内源溴结构域；将JQ1类似物与VHL配体连接构建AGB1，可特异性降解BRD4 BD2^L387A标记蛋白，表现出高D_max、低纳摩尔级DC₅₀及对野生型BRD2/3/4无明显降解活性，且降解可逆、细胞毒性低、体内药代性质良好。另一策略采用BRD4 BD1^L94V标签，将JQ1类似物与沙利度胺连接形成XY-06-007，通过招募CRBN选择性降解BRD4 BD1^L94V标记蛋白；报告基因和蛋白质组学验证了其高效性和高选择性，静脉及腹腔注射显示良好药代特征。

ZF-tag
免疫调节药物（IMiDs）如沙利度胺及其类似物可结合CRBN并促进新底物蛋白招募、泛素化与降解。IMiD结合的CRBN通常识别β-发夹结构中含甘氨酸的片段，如IKZF1和IKZF3共有的Cys₂-His₂（C2H2）锌指结构，因此该序列可作为降解标签（ZF-tag）。与dTAG、HaloPROTAC等双功能降解剂不同，ZF-tag系统中的IMiDs作为分子胶，结合CRBN后重塑底物识别表面并形成可被ZF-tag识别的复合界面；二者最终均促进三元复合物形成和泛素依赖的蛋白酶体降解，但招募模式不同。研究证实IKZF1中ZF2结构域对CRBN结合关键，单个约23个氨基酸的ZF结构足以诱导融合蛋白降解；通过C2H2 ZF文库筛选获得多种可诱导eGFP降解的锌指，并明确螯合锌的半胱氨酸、组氨酸及β-转角甘氨酸为IMiD识别的关键残基。为降低传统IMiDs对內源底物的脱靶降解，研究人员提出“Super Degron”概念，将不同人类ZF结构域组装以获得更强IMiD诱导降解效率，并用于CAR-T激活/失活控制。进一步研究开发正交IMiD衍生物PT-179及噬菌体辅助连续进化（PACE）平台，获得与PT-179和CRBN形成紧密三元复合物的SD40标签；冷冻电镜分析显示PT-179保持经典IMiD结合模式，而C5吗啉取代改变新底物识别表面，SD40可适配该修饰界面并实现选择性降解。PT-179可有效降解SD40标记的eGFP、PRKRA、NanoLuc和Fluc等蛋白，且蛋白质组学显示对內源沙利度胺/泊马度胺底物影响较小；SD40的Cas9/HDR敲入效率显著高于FKBP12^F36V。总体而言，ZF-tag具有分子量小、易精确编辑入靶基因编码框、SD40可检测脱靶降解少等优势，在靶点验证、蛋白功能研究、药物筛选和治疗控制中具有潜力。

其他
其他蛋白水平控制降解标签系统包括：植物来源生长素诱导降解（AID）系统，以IAA17或mini-AID/mAID为标签，在IAA诱导下经SCF泛素连接酶降解融合底物，具有降解快速等优点，但存在IAA剂量高、无生长素时泄漏降解及需引入植物源TIR1等局限；“bump-and-hole”策略可部分缓解高剂量和泄漏问题，但仍需外源F-Box蛋白。不稳定结构域（DD）系统将FKBP12突变体如L106P与目标蛋白融合，无配体时暴露降解信号而被蛋白酶体降解，加入Shield 1后配体结合使DD重折叠并屏蔽降解信号，实现快速、剂量依赖的可逆调控；后续还发展了基于ecDHFR、雌激素受体和UnaG的DD系统，但需持续给予Shield 1以维持目标蛋白稳定性和功能。配体诱导降解（LID）系统为DDFKBP改良版，在FKBP12突变体C端添加19个氨基酸degron，Shield 1竞争性暴露degron并触发泛素-蛋白酶体依赖降解；LID标签只能诱导C端融合目标蛋白降解，且Shield 1水溶性和药代性质较差，AquaShield 1等改良配体已用于体内CAR控制。小分子辅助关闭（SMASh）系统融合自切割降解标签，无药物时NS3自切割释放天然蛋白，加入丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂如Asunaprevir后阻断切割，使新合成蛋白保留NS4A疏水结构域并经蛋白酶体和自噬-溶酶体途径快速降解；该系统具有剂量依赖、可逆和临床安全药物兼容等优点，但NS4A疏水结构域可能干扰蛋白定位或功能。CH6-Tag系统基于含半胱氨酸的六组氨酸标签，通过双功能分子SNIPER（CH6）的马来酰亚胺与CH6共价结合、Ni-NTA识别组氨酸序列，另一端招募E3连接酶促进靶蛋白泛素化降解；CH6标签仅7个氨基酸，但SNIPER（CH6）细胞通透性差，需促渗透载体肽。线粒体靶向tTPD系统利用双功能分子WY165将mSA结合配体desthiobiotin与线粒体蛋白酶ClpP激活剂TR79相连，促进mSA标记蛋白靠近线粒体基质内ClpP并诱导ClpP依赖降解，实现空间限制性tTPD；该策略扩展了tTPD应用范围，但ClpP激活剂可能影响内源线粒体蛋白周转。

发光型标签
发光型标签可实现活细胞中蛋白丰度的实时、非破坏性定量监测，便于高通量筛选降解剂和比较降解动力学。目前已有基于NanoLuc和HiBiT-SpyTag的tTPD系统。

NanoLuc
NanoLuc为19 kDa高亮度、小体积且商业支持完善的标签。研究人员将NanoLuc抑制剂与CRBN配体偶联构建NanoTACs，使NanoLuc标记靶蛋白连接至CRBN，劫持CRL4^CRBN复合物诱导泛素化及蛋白酶体降解。利用表达HaloTag、萤火虫荧光素酶、NanoLuc和FKBP12^F36V融合蛋白的平台筛选NanoTAC1-5，其中NanoTAC/NC4的DC₅₀为21.6 nM、D_max为77%，蛋白水平2 h内下降并可维持10 h以上，连续给药可稳定降解24 h，洗脱5 h后24 h内恢复，显示可逆控制；定量蛋白质组学未发现明显脱靶降解。与HaloTag、dTAG和NanoTAC比较，FKBP12^F36V-VHL系统降解效率最高，FKBP12^F36V-CRBN次之，HaloPROTAC-VHL与NanoTAC/NC4相当但持续反应较差。NanoTAC/NC4可降解MLKL-NanoLuc并剂量依赖阻断HT29细胞坏死性凋亡；虽然降解效率略低于dTAG FKBP12^F36V-VHL系统，但具有荧光素酶实时报告、化合物催化循环和低脱靶风险等优势。

HiBiT-SpyTag
HiBiT-SpyTag将11个氨基酸HiBiT标签（与LgBiT互补发光）与13或14个氨基酸SpyTag/SpyTag002（与SpyCatcher共价结合）组合，形成24–25个氨基酸的紧凑功能标签模块。研究人员利用CRISPR将HiBiT-SpyTag插入目标蛋白N端或C端，瞬时表达dTAG SpyCatcher使SpyTag与SpyCatcher快速偶联，再加入dTAG-13或dTAGV-1招募E3连接酶促进泛素化及蛋白酶体降解，同时通过HiBiT-LgBiT发光实时报告降解过程。该系统成功降解HEK293T细胞中BRD4和IRE1α，并证实实际降解与HiBiT信号下降一致。与FKBP12^F36V、HaloTag等较大标签相比，HiBiT-SpyTag部分旨在解决大标签敲入效率低的问题；SpyCatcher可按需更换E3招募模块，便于快速验证候选靶点可降解性并指导后续PROTAC设计。其局限包括需额外转染dTAG-SpyCatcher、转染效率低会降低效果、转染24 h后BRD4和IRE1α模型仍有未共价捕获蛋白导致D_max约60–70%，以及SpyTag-SpyCatcher偶联不可逆，难以研究动态过程并可能长期扰动蛋白复合物平衡。

基于纳米抗体的tTPD系统
基于纳米抗体的tTPD系统通常利用小抗体片段引导带标签蛋白进入UPS，以替代小分子配体。此类系统将抗GFP单域抗体片段与E3连接酶关键结构域（如F-box或VHL）融合，形成“分子钩”直接捕获带标签靶蛋白并经泛素-蛋白酶体途径降解。纳米抗体体积小、可及性高、稳定性好，适用于受控蛋白降解和带标签蛋白功能研究。

deGradFP
deGradFP由Caussinus等开发，通过将F-box蛋白Slmb N端结构域与高亲和抗GFP单域抗体VhhGFP4融合，构建人工F-box蛋白NSlmb-vhhGFP4，将GFP标记靶蛋白精准递送至SCF E3泛素连接酶复合物，诱导多泛素化及蛋白酶体降解。HeLa S3细胞中转染NSlmb-vhhGFP4 24 h后H₂B-GFP荧光显著减弱，而对照蛋白不受影响；果蝇中EYFP信号在2–3 h内降至10%。deGradFP无需小分子降解剂，可高效降解细胞核、细胞质和细胞膜GFP标记蛋白，但GFP标签（27 kDa）较大，可能干扰靶蛋白正常折叠和功能；哺乳动物细胞中依赖质粒瞬时转染，缺乏时序性和可逆性。VhhGFP4-SPOP（Ab-SPOP）利用CUL3-SPOP-RBX1通路提高了核蛋白降解效率并可用于斑马鱼早期胚胎，但未解决deGradFP的关键问题。

AdPROM
AdPROM系统采用VHL与抗GFP纳米抗体aGFP16的嵌合融合蛋白，VHL结构域招募CUL2-Rbx1-EloB/C复合物，纳米抗体特异性结合GFP标记靶蛋白，通过诱导邻近促进靶蛋白多泛素化并由26S蛋白酶体降解。该系统在HEK293和U2OS细胞中实现GFP-VPS34和PAWS1-GFP近完全清除，2 h内可检测靶蛋白下降、6 h接近完全降解；VPS34降解后细胞内PI3P荧光斑点几乎消失，功能验证与小分子抑制剂效果相当。通过替换结合臂为单克隆抗体或纳米抗体，AdPROM还可降解未标记内源蛋白；利用CRISPR/Cas9在内源KRAS位点敲入GFP标签后，VHL-aGFP16可实现快速稳健降解。第一代AdPROM采用多西环素诱导融合蛋白表达，存在激活较慢、实时调控受限等不足；L-AdPROM将HaloTag与高亲和纳米抗体融合，仅在加入HaloPROTAC-E等同时结合HaloTag和VHL的小分子时招募靶蛋白至CUL2-RBX1，实现配体诱导降解。纳米抗体tTPD还可扩展E3连接酶库，例如系统筛选并表征KLHDC2、KLHL6、RNF125、RNF144A和SIAH2等，并以SelK C端肽作为KLHDC2识别基序设计p-PROTAC。与配体tTPD相比，纳米抗体系统提供新的UPS干预方式并便于荧光可视化，但仅依赖NSlmb-vhhGFP4或VHL-aGFP16缺乏即时可控性；改进的AdPROM虽具一定优势，但降解效率相对dTAG较低，且“分子钩”中间体和额外外源基因引入使操作更复杂。

讨论
快速耗竭内源蛋白是研究蛋白功能和验证靶点的重要途径。CRISPR干扰（CRISPRi）、RNA干扰（RNAi）和CRISPR-Cas13可在RNA水平抑制靶基因表达，但不同蛋白半衰期差异可导致蛋白耗竭速度较慢或不一致，难以评估蛋白水平急性变化的影响，并可能产生代偿或脱靶效应。tTPD系统可实现快速且常可逆的靶蛋白降解，模拟PROTAC或其他TPD系统的作用，便于评估快速降解后的功能影响和表型变化。选择合适tTPD平台应依据生物学背景和实验目的，而非仅看降解效力：需考虑POI亚细胞定位、结构组织、蛋白复合物参与、N端或C端融合耐受性；所招募降解机器在细胞或组织环境中的兼容性；降解效能、最大降解、动力学、可逆性、基底降解、脱靶效应和hook效应；以及标签大小、基因组编辑效率、额外遗传组件需求、报告能力和体内兼容性。因此，没有单一标签可视为普遍最优，平行比较不同标签–降解剂组合可能更可靠。当前tTPD仍面临挑战：已充分表征的标签–降解剂对相对有限，多数平台仅利用有限降解机器，替代蛋白水解途径和亚细胞区室探索不足，许多新系统在生理相关模型和体内环境中的性能表征不充分。拓展tTPD工具箱可通过优化现有degron框架、定向进化、将配体结合蛋白模块重用作降解标签并偶联替代降解机器、利用选择性分子胶–新底物相互作用提供可转移degron等策略实现。未来标签开发应优先关注小型化、正交性、对POI功能扰动小、高效可逆降解、低基底和脱靶活性、灵活融合几何及与多样细胞和体内环境兼容。除蛋白降解外，tTPD所依据的标签诱导邻近原理还可拓展至条件性触发开关、邻近标记蛋白质组学、功能重定向、合成基因回路控制节点，以及从单靶点验证到 scalable、条件性蛋白水平靶点筛选和临床前决策平台。