基于微光流控芯片的无标记原位微粒浓度估算方法研究

《Sensors》：Label-Free In-Situ Estimation of Microparticle Concentration in Micro-Optofluidic Device

　　

在嵌入式芯片实验室平台中，微粒的原位检测与定量仍然具有挑战性，因为有限的光学可及性使得基于显微镜的传统分析方法难以实施。为克服这一限制，本研究开发了一种微光流控平台，将光传输与检测直接集成于器件内部，从而无需外部成像或样品提取即可实现无标记浓度估算。该传感原理利用微通道内微粒散射引起的透射光浓度依赖性变化。研究采用HL60细胞和PMMA微粒（CA6）在五个浓度水平（从无微粒条件到107 MPs·mL-1）对该平台进行了评估，分别在相干激光和LED照明条件下进行。光线追踪模拟再现了器件内部的光传播和微粒-光相互作用，预测了检测光纤收集的光通量中与微粒相关的差异，与实验响应一致。测量结果显示，随着微粒浓度的增加，透射信号逐渐减小，其中激光照明相比LED照明提供了更高的灵敏度和更清晰的两种微粒类型区分度。三因素方差分析（three-way ANOVA）证实，微粒类型、浓度和照明光源及其交互作用均显著影响检测到的光信号（p值 < 0.001）。这些发现表明，集成光学架构能够区分生物和合成微粒悬浮液中浓度依赖性的响应差异。所提出的平台代表了一种紧凑且完全无标记的原位微粒监测解决方案，支持自包含微流控传感平台的未来发展。

论文解读

研究背景与问题

芯片实验室技术通过在微型化流体环境中集成样品处理、传输和分析功能，实现了对微小流体体积的精确控制，同时减少了样品消耗、试剂需求和分析时间，在生物临床分析、药物研发、化学处理、环境监测和工业质控等领域得到广泛应用。在许多应用中，微流控样品含有悬浮的生物细胞或合成微粒，对其表征可提供所研究系统的状态、组成或演化信息。其中，悬浮细胞或微粒的浓度是众多生物和技术应用中的基本指标，如细胞增殖监测、活力评估、生物过程控制、微粒合成与配方控制以及过滤分离程序等。

微粒浓度测量的分析策略可分为离芯片（off-chip）和芯片上（on-chip）两大类。离芯片分析需要从器件中取出流体等分样品，再采用流式细胞术或分光光度法等常规技术检测，虽然能提供准确详细的信息，但采样引入了检测延迟，通常只能提供离散或终点测量，同时消耗生物材料、可能扰动所研究系统，并引入与样品转移、稀释、污染或微粒沉降相关的变异性。这些局限在封闭式微流控平台和长期细胞实验中尤为突出，因为连续和非破坏性监测更为理想。相反，芯片上方法将传感功能集成于微流控平台内，可在保持样品环境的同时直接在器件内进行测量，可提高时间分辨率、减少样品处理并支持实时监测和反馈控制。

目前已开发了多种芯片上检测原理，包括电阻抗法、声学和声流控方法、电化学传感器以及光学方法。其中，基于透射和散射的光学测量可以无标记方式实现，无需荧光或生化标记，简化了样品制备并降低了标记过程改变细胞或微粒的风险。显微镜虽是最广泛采用的无标记光学方法，但通常需要通道与外部物镜之间存在直接且足够透明的光路，以及显微镜、相机、照明系统和图像采集处理程序，这在多层或嵌入式芯片实验室平台中可能受到限制，且依赖外部成像仪器限制了系统的紧凑性和便携性。因此，当直接可视化不切实际或与目标器件架构不兼容时，需要在芯片内局部操作的免成像检测策略。

微光流控技术通过在统一平台内结合光学和微流控组件，为解决上述限制提供了合适框架。光纤、波导、透镜和光电探测器可耦合或集成到微流控器件中，直接在选定检测区域传输和收集光。与自由空间光学配置相比，照明路径、微通道和收集元件之间的相对对准可由芯片本身的几何结构决定，可提高测量重现性、减少重复手动对准需求并将光学测量限制在明确界定的体积内。尽管已有多种免成像光流控方法被提出用于微粒检测，但对使用一对相对光纤在连续单相流中无标记、免成像地估算体相微粒浓度，特别是同时涵盖生物细胞和合成微粒并在不同照明条件下进行的研究仍相对有限。

研究内容与结论

本研究提出了一种微光流控平台，用于微通道中微粒浓度的无标记原位估算。该器件集成了用于光传输和收集的相对光纤，直接在流动悬浮液中定义光学检测体积。研究采用HL60细胞和CA6合成微粒在五个浓度水平下，分别在相干激光和LED照明下考察其响应。通过光线追踪模型分析检测区域内光的传播和微粒引起的光重新分布，实验测量表征浓度依赖性透射信号，并采用三因素方差分析量化微粒类型、浓度、照明光源及其交互作用的影响。研究结果表明，集成光学架构能够区分生物和合成微粒悬浮液中浓度依赖性响应差异，该平台代表了紧凑且完全无标记的原位微粒监测解决方案。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：第一，基于喷墨3D打印的主-模（master–slave）方法制造聚二甲基硅氧烷（PDMS）微光流控器件，通过3D打印模具浇铸PDMS并等离子处理键合形成含微通道和光纤槽的器件结构。第二，采用非序列蒙特卡罗光线追踪方法，使用TracePro软件建立包含微通道、光纤槽和照明/检测光纤的完整器件几何模型，模拟微粒存在下的光传播和收集光通量。第三，构建包含20个球形微粒的确定性空间分布模型，通过五个面板和四个中间平面组装形成光学检测体积的三维模型。第四，采用相干激光和宽带LED两种照明条件，通过光纤耦合传输光，使用光电二极管和示波器以1.5 kHz采样率采集透射信号，并在MATLAB中进行低通滤波和平滑处理后计算均值。第五，采用三因素方差分析（three-way ANOVA）对微粒类型、浓度和照明光源及其交互作用进行统计检验。样本包括HL60细胞（平均直径15 μm，悬浮于PBS）和CA6合成微粒（标称直径6 μm，悬浮于80:20甘油-去离子水混合物）。

研究结果

光线追踪模拟

光线追踪模拟结果初步解释了入射光与两种微粒悬浮液之间的相互作用。HL60和CA6模型的不同光线轨迹表明，光功率的空间重新分布取决于分配给微粒及其周围介质的性质。CA6配置表现出更明显的角度重新分布，更大比例的光学路径偏离直接光源-接收器方向。在相同浓度下，CA6悬浮液相比HL60悬浮液产生了约18%的收集光功率降低。这一差异不能仅归因于微粒直径，尽管HL60细胞标称直径大于CA6微粒，但模拟预测HL60模型具有更高的透射通量。光学响应由微粒尺寸、微粒与其悬浮介质之间的折射率对比度以及表面性质的组合效应决定。CA6系统的组合光学对比度和表面相互作用导致从收集区域损失更多功率，克服了其较小微粒直径的预期效应。

浓度依赖性光学响应

在激光照明下，两种微粒类型均表现出清晰的浓度依赖性响应。HL60细胞的平均信号从无微粒条件下的约1.91 V降至10⁷浓度下的约1.65 V，总体降低约13.6%。CA6微粒的信号从约1.89 V降至约1.24 V，总体降低约34.4%。线性回归斜率分别为HL60的约-1.77×10^-7 V·mL·MPs^-1和CA6的约-7.18×10^-7 V·mL·MPs^-1，CA6斜率约为HL60的四倍，定量证实了检测光信号对CA6浓度变化具有更高灵敏度。在LED照明下，信号幅度较低且浓度依赖性变化减小。HL60信号从约0.98 V降至约0.85 V，总体降低约13.3%，但回归斜率较小且决定系数较低。CA6信号从约0.98 V降至约0.69 V，总体降低约29.6%，保持了较清晰的浓度与透射信号之间的反比关系。不同响应可归因于两种照明源的发射特性和耦合效率差异，单色定向激光产生更高检测信号和更明显的浓度依赖性变化，而LED照明产生较低信号和较小变化。

方差分析

三因素方差分析结果显示，所有三个主效应均显著影响检测光信号：微粒类型（F值=412.46，p<0.001）、浓度（F值=329.13，p<0.001）和照明光源（F值=173,312.63，p<0.001）。所有两因素交互作用也均显著：类型-浓度交互（F值=96.97，p<0.001）表明浓度依赖性变化在HL60和CA6之间不同；类型-光源交互（F值=477.33，p<0.001）表明两种微粒类型之间的差异取决于所选照明光源；浓度-光源交互（F值=188.41，p<0.001）表明浓度效应取决于照明配置。三因素交互（类型×浓度×光源，F值=88.66，p<0.001）表明HL60和CA6的不同浓度响应本身依赖于照明光源。因此，微粒类型、浓度和照明光源的效应不能独立解释。

讨论与结论

数值模拟、实验测量和统计分析结果之间的一致性确立了所提出平台作为无标记原位检测生物和合成微粒悬浮液中浓度依赖性变化的可靠概念验证。激光照明在整个研究浓度范围内对HL60细胞产生约13.6%的信号降低，对CA6微粒产生约34.4%的信号降低，表现出最高浓度灵敏度。LED照明对CA6微粒保持了浓度依赖性趋势，但灵敏度低于激光，而HL60细胞仅观察到弱且不均匀的变化。统计确认微粒类型、浓度和照明光源显著影响检测信号，其交互作用也显著，表明浓度依赖性响应由微粒性质和照明条件共同决定。

未来发展方向将聚焦于相干照明，研究光学响应的波长依赖性，以确定微粒散射和透射信号衰减如何随生物和合成微粒的光学性质变化。此外，该方法将扩展到不同尺寸、形状、刚度和光学性质的微粒和细胞，并将在包含外部无法通过常规成像访问的嵌入式微通道的多层器件中进行评估，这类配置是所提出的原位传感方法的特别相关应用，因为光学检测可在器件内直接执行而无需对微流控层进行视觉访问。