《iScience》：BDCA2-dependent phagocytosis enables strain-specific activation of plasmacytoid dendritic cells by lactic acid bacteria
编辑推荐：
浆细胞样树突状细胞（pDCs）通过内体Toll样受体9（TLR9）检测微生物DNA，然而其选择性内化特定细菌的机制仍不清楚。研究人员证明，针对乳酸菌（LAB）的I型干扰素（IFN-I）应答完全依赖于吞噬作用，并表现出显著的菌株特异性。在所测试的菌株中，乳酸乳球
浆细胞样树突状细胞（pDCs）通过内体Toll样受体9（TLR9）检测微生物DNA，然而其选择性内化特定细菌的机制仍不清楚。研究人员证明，针对乳酸菌（LAB）的I型干扰素（IFN-I）应答完全依赖于吞噬作用，并表现出显著的菌株特异性。在所测试的菌株中，乳酸乳球菌Plasma菌株（LC-Plasma）可被高效吞噬，并在原代人pDCs和CAL-1细胞中强效诱导IFN-α，而与之密切相关的菌株则表现出极低的摄取量和细胞因子产生水平。吞噬作用对于TLR9依赖性IFN-α分泌至关重要。转录组学和功能分析鉴定出BDCA2——一种半乳糖结合性C型凝集素受体——是乳酸菌摄取的关键介导因子。阻断BDCA2可显著损害吞噬作用和细胞因子应答。BDCA2-Fc融合蛋白可与乳酸菌强效结合。聚糖谱分析鉴定出与高效吞噬的乳球菌菌株相关的聚糖特征。这些发现将BDCA2依赖性吞噬作用定义为人pDCs对乳酸菌进行菌株特异性识别的一个关键决定因素。
浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）是一类专职产生I型干扰素（type I interferons, IFN-I）的树突状细胞亚群，通过内体中的Toll样受体7（TLR7）和Toll样受体9（TLR9）识别病原体来源的核酸，在抗病毒免疫中发挥关键作用。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）广泛存在于环境和食品中，构成小肠微生物群的重要部分，可影响宿主多种免疫细胞的成熟与功能。然而，尽管金黄色葡萄球菌等病原微生物已被证实可激活pDCs，仅有特定乳酸菌菌株能够直接触发pDC应答，且其分子机制长期未明。乳酸乳球菌Plasma菌株（LC-Plasma, JCM5805）是首个被鉴定为可直接强效激活pDCs并诱导IFN-I产生的乳酸菌菌株，其通过TLR9-MyD88信号轴激活小鼠pDCs，但DNA基序分析无法完全解释菌株特异性。此前研究虽提示吞噬作用可能参与其中，但尚未确立吞噬摄取是否直接决定菌株特异性IFN-I应答，也未鉴定调控细菌内化的关键受体。鉴于原代人pDCs在外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中占比不足0.5%且不增殖，加之小鼠骨髓来源树突状细胞缺乏BDCA2等人源特异性受体，建立合适的人源模型系统成为解析pDC-细菌相互作用的关键。
研究人员通过优化人pDC样CAL-1细胞系在血清饥饿条件下的培养体系，建立了可有效研究乳酸菌感知的实验模型，并在原代人pDCs中验证了关键发现。研究首先证实，LC-Plasma通过pHrodo Red标记的剂量依赖性摄取与IFN-α产生密切相关，共聚焦z轴成像确认细菌的胞内定位；细胞松弛素D（cytochalasin D）和拉特伦库林B（latrunculin B）等肌动蛋白聚合抑制剂完全消除IFN-α产生，证明吞噬作用是pDC激活的必要前提。TLR9特异性抑制剂ODN A151和溶酶体酸化抑制剂氯喹均完全阻断IFN-α产生，表明内体DNA感知是下游关键事件。在涵盖乳球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属及其他球菌属（片球菌属、明串珠菌属、酒球菌属）的多样乳酸菌菌株库中，吞噬活性与IFN-α产生呈正相关，且乳球菌属的回归斜率最大，表明该属对吞噬摄取的依赖性最强；双歧杆菌属的斜率最小，其摄取对细胞因子应答贡献有限。值得注意的是，同一属内也存在显著菌株差异：LC-Plasma被高效吞噬并强效激活pDCs，而密切相关菌株LC-15577摄取量极低且不能诱导IFN-α，这一菌株特异性在原代人pDCs中同样得到验证。
为鉴定介导乳酸菌摄取的受体，研究人员利用CAL-1细胞对LC-Plasma应答的异质性，通过有限稀释法获得吞噬能力差异显著的单细胞克隆，吞噬高克隆的LC-Plasma摄取量较吞噬低克隆高18.5倍，且与IFN-α产生增加相关。RNA测序（RNA-seq）分析聚焦模式识别受体，发现BDCA2（CLEC4C, CD303）和TLR10在吞噬高克隆中上调，流式细胞术确认BDCA2表面表达升高。LC-Plasma而非LC-15577刺激可诱导CAL-1细胞中BDCA2基因表达。在多种人C型凝集素受体（C-type lectin receptors, CLRs）Fc融合蛋白（BDCA2、CLEC9A、CLEC4A、DC-SIGN）与FITC标记乳酸菌的结合筛选中，BDCA2对所有测试菌株均表现出最强的结合能力，而其他CLRs几乎无结合。功能研究显示，BDCA2中和抗体AC144可剂量依赖性地抑制LC-Plasma摄取和IFN-α产生，且该抑制在排除死细胞后依然显著；BDCA2阻断不影响CAL-1细胞对乳胶微球的吞噬，排除了非特异性吞噬功能损伤。在原代人pDCs中，BDCA2阻断同样损害LC-Plasma摄取和IFN-α产生。凝集素阵列分析显示，LC-Plasma与花生凝集素（peanut agglutinin, PNA）强结合，PNA反应性与乳球菌属菌株的吞噬效率相关，提示高效吞噬菌株富集半乳糖相关聚糖特征。
讨论部分指出，血清饥饿增强CAL-1细胞吞噬反应性而非诱导非特异性摄取，多项证据支持这一结论：6小时时间点细胞活力基本不变时已出现显著菌株依赖性摄取，BDCA2阻断特异性抑制LC-Plasma摄取而不影响乳胶微球吞噬，且关键发现在原代人pDCs中均得到验证。不同乳酸菌属间吞噬指数与IFN-α产生相关斜率的差异提示，细菌表面特征和内体DNA配体（如CpG基序）共同塑造pDC激活，双歧杆菌属作为人类肠道优势共生菌属可能进化出限制过度pDC激活的机制以维持免疫稳态。BDCA2作为人pDCs独特表达的受体，其介导的细菌识别可能在肠道相关淋巴组织中的pDC-微生物群相互作用中发挥作用，但BDCA2识别聚糖结构在共生菌中的分布程度尚不清楚。研究结论为：人pDCs通过BDCA2介导的吞噬作用选择性识别和应答免疫刺激性乳酸菌菌株，吞噬将细菌递送至酸化内体，细菌DNA经TLR9触发IFN-I产生和共刺激分子表达，该机制为合理设计增强抗病毒免疫的下一代益生菌奠定了基础。
研究的主要技术方法包括：利用人pDC样CAL-1细胞系在胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）剥夺条件下建立优化模型，并在原代人pDCs（购自STEMCELL Technologies或从iQ Biosciences提供的健康成人供者PBMCs中分离，纯度85%–97%）中验证关键发现；采用pHrodo Red标记结合Incucyte活细胞成像系统定量吞噬作用；使用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）进行z轴堆叠成像确认细菌胞内定位；通过流式细胞术分析吞噬阳性细胞比例及CD40、CD86等激活标志物表达；利用RNA-seq转录组分析比较吞噬高/低克隆的模式识别受体表达差异；采用CLEC-Fc融合蛋白结合实验筛选乳酸菌结合受体；使用中和抗体阻断BDCA2验证其功能；利用凝集素阵列分析细菌表面聚糖特征。
研究结果分为四个部分。第一部分“吞噬作用和TLR9信号传导是LC-Plasma激活人pDCs所必需的”：通过pHrodo Red标记的剂量依赖性摄取与IFN-α产生相关分析、z轴堆叠共聚焦成像、细胞松弛素D和拉特伦库林B抑制实验、TLR9抑制剂ODN A151和氯喹处理，证实LC-Plasma通过吞噬作用依赖性、TLR9介导的途径激活人pDCs，且该途径同时调控CD40和CD86上调。第二部分“吞噬作用预测不同乳酸菌属间菌株特异性IFN-α应答”：对涵盖四个属的乳酸菌菌株库分析显示，吞噬活性与IFN-α产生呈正相关，乳球菌属斜率最陡，双歧杆菌属斜率最缓；乳球菌属整体吞噬摄取和IFN-α产生显著高于其他属；同一属内LC-Plasma与LC-15577的显著差异在原代人pDCs中同样存在。第三部分“转录组分析鉴定BDCA2为高效乳酸菌摄取相关受体”：通过单细胞克隆筛选获得吞噬能力差异显著的亚群，RNA-seq发现BDCA2和TLR10在吞噬高克隆中上调，流式细胞术确认BDCA2表面表达升高，且LC-Plasma而非LC-15577刺激诱导BDCA2基因表达。第四部分“BDCA2是人C型凝集素受体中主要的乳酸菌结合受体”及“BDCA2是人pDCs中介导乳酸菌吞噬的关键受体”：在BDCA2、CLEC9A、CLEC4A、DC-SIGN中，BDCA2-Fc对所有测试乳酸菌菌株表现出最强结合；BDCA2中和抗体AC144剂量依赖性抑制LC-Plasma摄取和IFN-α产生，且不影响乳胶微球吞噬；BDCA2阻断同样抑制其他乳球菌菌株的摄取，并在原代人pDCs中验证了该效应。
讨论部分总结了研究的主要发现和意义：FBS剥夺增强CAL-1细胞吞噬和IFN-I产生，建立了经济可行的体外模型；吞噬效率是菌株特异性pDC应答的主要决定因素；BDCA2是人pDCs中乳酸菌识别和吞噬的关键受体，其阻断显著损害细菌摄取和IFN-α产生；BDCA2-Fc融合蛋白对乳酸菌的结合强于其他测试CLRs，表明BDCA2是pDCs中乳酸菌识别的主要CLR。不同属间相关斜率的差异提示细菌表面特征和DNA配体共同塑造pDC激活，双歧杆菌属可能通过限制pDC过度激活维持肠道免疫稳态。研究结论为：人pDCs通过BDCA2介导的吞噬作用和TLR9依赖性IFN-α产生选择性应答乳酸菌菌株，该机制为筛选或工程化改造具有增强免疫调节特性的乳酸菌菌株提供了平台，为合理设计旨在增强抗病毒免疫和维持免疫稳态的下一代益生菌奠定了基础。
