血浆CCDC88A表达联合红细胞沉降率与类风湿关节炎疾病活动度的关联：一项横断面探索性研究

《Journal of Inflammation Research》：Association of Plasma CCDC88A Expression Combined with Erythrocyte Sedimentation Rate with Rheumatoid Arthritis Disease Activity: A Cross-Sectional Exploratory Study

　　

背景 类风湿关节炎（RA）疾病活动度采用复合临床指数评估，这些指数整合体格检查发现、患者与医师报告评估及实验室标志物。循环RNA可能提供互补的分子信息，但用于当前RA活动度的血浆RNA标志物证据仍有限。目的 识别与横断面RA疾病活动度相关的血浆RNA转录本，并探索血浆RNA浓度与血液学参数联合时是否提供互补的判别信息。患者与方法 本横断面两阶段研究采用靶向RNA测序筛查25例确诊RA患者和14例健康对照（HCs）的血浆。RA患者分为高疾病活动度（HDA；DAS28-ESR >5.1，n=13）或低疾病活动度/缓解（LDA/缓解；DAS28-ESR ≤3.2，n=12）。先导候选CCDC88A的表达通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）在108份血浆样本中评估，包括78例RA患者和30例HCs。结果 血浆CCDC88A表达在RA患者中低于HCs（中位[四分位距]，0.55[0.29–0.81] vs 0.94[0.59–1.12]；p=0.003）。对于中等活动度与LDA/缓解之间的横断面判别，CCDC88A的曲线下面积（AUC）为0.659，红细胞沉降率（ESR）为0.746，二者联合为0.785。结论 分子标志物与外周血来源参数（如ESR）联合时，可能潜在地作为RA疾病活动度的支持性指标。关键词：生物标志物；CCDC88A；circRNA；类风湿关节炎；RNA-seq。

研究背景：类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）为慢性系统性自身免疫病，特征为持续滑膜炎、关节结构损伤、功能受损和生活质量下降。达标治疗需用疾病活动度评分28（Disease Activity Score 28, DAS28）、临床疾病活动指数（Clinical Disease Activity Index, CDAI）和简化疾病活动指数（Simplified Disease Activity Index, SDAI）等复合指数反复评估当前活动度。C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）和红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）常用，但ESR非特异、部分活动期RA可正常、可与组织炎症不一致，早期或轻度病例可低估炎症；因此需互补生物标志物而不替代临床评估。循环RNA可能提供补充分子信息，但血浆RNA与当前RA活动度证据有限；环状RNA（circular RNA, circRNA）因抗外切酶受关注，但环状本身不等于疾病相关性，circRNA导向面板中的线性转录本也可能成为候选。故研究人员开展横断面两阶段研究，识别与横断面RA活动度相关的血浆RNA转录本，以定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）验证先导候选CCDC88A，并探索其与血液学参数尤其ESR联合的判别价值。

研究人员开展的研究与结论：筛查25例RA和14例健康对照（healthy controls, HCs）血浆，RA分高疾病活动度（high disease activity, HDA；DAS28-ESR>5.1，n=13）和低疾病活动度/缓解（low disease activity/remission, LDA/缓解；DAS28-ESR≤3.2，n=12）。qPCR验证108份血浆（78例RA、30例HCs）。结论为RA患者血浆CCDC88A低于HCs；中等活动度与LDA/缓解比较，CCDC88A、ESR及联合的曲线下面积（area under the curve, AUC）分别为0.659、0.746、0.785。意义在于分子标志物与外周血参数联合可能作为RA活动度支持指标，但属探索性，需独立验证。

关键技术方法（≤250字）：采用靶向RNA测序筛查（Ion AmpliSeq Circular RNA Research Panel，271个扩增子，含线性和环状转录本及阴性对照；Ion S5测序；β-actin归一化），并以qPCR验证（血浆RNA提取、逆转录、GAPDH内参、ΔΔCt法、2^?ΔΔCt、三技术重复及熔解曲线）。筛查队列来自连续医院入院的25例RA和14例HCs；验证队列108例（78例RA、30例HCs），包含筛查样本并补充，HCs来自门诊非炎症/自身免疫就诊者及健康志愿者。统计包括Shapiro-Wilk、Mann-Whitney U/Kruskal-Wallis、Spearman、ROC、logistic回归、DeLong检验及多变量线性回归。

结果：
测序质量指标（Sequencing Quality Metrics）：5次独立测序，平均10.5 Gb/run、79.8 million reads、平均读长132 bp；比对率99.6%、原始准确度99.0%、平均覆盖深度89,714×；每样本mapped reads均值9.67×10⁶（中位10.12×10⁶），on-target 99.90%，靶标检测率84.82%。结论为测序质量可靠。
筛查阶段血浆靶向RNA转录本与横断面疾病活动度的关联（Associations Between Targeted Plasma RNA Transcripts and Cross-Sectional Disease Activity in the Screening Phase）：以靶向circRNA测序作定量筛查，20个转录本符合大效应（3上调、17降低）；多重校正后CCDC88A_LINOUT、DYNC1LI2_LINOUT、FGGY_LINOUT、LDB2_CIRC、MYT1L_LINOUT在HDA较LDA降低；ANOVA仅CCDC88A_LINOUT和MYT1L_LINOUT在三组间有统计支持。筛查ROC中压痛关节数（tender joint count, TJN）AUC=1.000、医师总体评估（physician global assessment, PhGA）0.971、ESR 0.968（部分因与DAS28-ESR定义相关）；CCDC88A_LINOUT AUC 0.891、MYT1L 0.808，为描述性，不证明前瞻性预测或独立临床效度；二者进入qPCR。
qPCR验证（Validation by qPCR）：先8例随机样本中MYT1L无可靠扩增（Ct>38或非特异）被排除；CCDC88A在RA低于HCs：0.55[0.29–0.81] vs 0.94[0.59–1.12]，p=0.003；活动性疾病（DAS28>3.2，n=62）vs HCs：0.52[0.26–0.75] vs 0.94[0.59–1.12]，p=0.003；中等活动度患者CCDC88A低于HCs（DAS28、CDAI、SDAI分别p=0.009、0.015、0.014）；CDAI高活动度vs HCs p=0.04；类风湿因子（rheumatoid factor, RF）阳性vs HCs 0.49[0.26–0.83] vs 0.94[0.59–1.12]，p=0.01；抗瓜氨酸化肽抗体（anti-citrullinated peptide antibodies, ACPA）阳性vs HCs数值降低。探索性ROC中等活动（n=32）vs LDA/缓解（n=16）：AUC CCDC88A 0.659、ESR 0.746、ESR+CCDC88A 0.785（较ESR绝对数值增加0.039）；ESR敏感性0.50、特异性0.94，联合敏感性0.97、特异性0.56；DeLong检验无显著差异（p=0.496、0.547、0.131）。因ESR为DAS28-ESR组分，存在纳入偏倚，不应解释为独立诊断性能或未来风险预测。外周血细胞计数指数中中性粒细胞/淋巴细胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR）、单核细胞/淋巴细胞比值（monocyte-to-lymphocyte ratio, MLR）在RA各活动度与HCs间不同，但不能区分活动度类别；ESR在HDA vs 中等p=0.007、HDA vs 缓解p<0.0001、中等vs HCs p=0.01、中等vs LDA/缓解p=0.09；CCDC88A+ESR改善中等vs LDA/缓解识别（p=0.03），但降低HDA vs 中等识别（p=0.15）。RA中仅ESR及CCDC88A+ESR与DAS28、CDAI、SDAI正相关（ESR与DAS28-ESR有数学重叠需谨慎）。多变量线性回归模型显著（R²=0.226，调整R²=0.130，F(8,65)=2.37，p=0.027）；生物制剂治疗（β=?0.319，p=0.012）、CCDC88A表达（β=?0.290，p=0.017）、病程（β=?0.274，p=0.023）独立关联DAS28；ACPA阳性趋势（β=?0.226，p=0.057）。

讨论总结：原文讨论指出，该研究提供首个探索性证据：较低血浆线性CCDC88A转录本与RA相关，ESR+CCDC88A评分可能在数值上改善选定活动度类别间横断面区分。虽因circRNA稳定性动机，qPCR可测候选为线性，故不支持circRNA特异性标志物主张；线性检测差异可能涉及back-splicing、转录本丰度、降解、胞外包装或释放，但设计不能区分。CCDC88A编码Girdin/GIV，参与PI3K–Akt信号、细胞骨架组织和定向迁移；胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor, IGF-1R）信号在RA激活并促进滑膜成纤维细胞生存增殖，GIV/Girdin可抑制Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）依赖巨噬细胞炎症信号；同家族CCDC88B与慢性炎症易感及树突状细胞迁移有关；但无研究直接证明CCDC88A驱动RA免疫细胞迁移、滑膜成纤维细胞侵袭或血管翳形成，需独立队列和机制研究。MYT1L筛查信号弱且qPCR不可重复，应视为技术和假设生成观察。ESR易测低成本但非特异，CRP/ESR可正常达40%，与组织炎症评分弱相关；联合CCDC88A+ESR提高敏感性0.50→0.97但降低特异性，筛查/早期检测可接受该权衡。主要临床指标TJN、肿胀关节数（swollen joint count, SJN）、患者总体评估（patient global assessment, PtGA）和PhGA的AUC大于CCDC88A，但比较不独立，因这些指标直接或间接参与活动度分类。当前结果不支持远程监测或治疗决策，因未评估纵向变化、临床判定复发或治疗反应。正式ROC比较无显著差异，联合模型AUC数值较高，提示潜在附加价值；CCDC88A与ESR性能相当支持其作为RA活动度相关独立生物标志物的潜在相关性。局限性包括横断面设计不能建立时间预测；靶向RNA panel限制全转录组发现；筛查和qPCR样本量不大，需更大队列（含其他结缔组织病/自身免疫病、早期RA和pre-RA）；以长病程RA为主且治疗多样，特定治疗影响不能可靠评估；需动物/细胞模型验证；β-actin用于测序归一化、GAPDH用于qPCR，但血浆无细胞RNA（cell-free RNA, cfRNA）内参稳定性未记录，可能阶段特异归一化偏倚；ROC使用ESR等DAS28组分对DAS28-ESR定义类别存在纳入偏倚，小样本模型乐观可能；未分析兼容外部血浆cfRNA数据集，因GEO数据集与长病程RA队列差异大，研究人员认为独立引物qPCR验证更合适。

研究结论翻译：在这项探索性横断面研究中，RA患者血浆CCDC88A表达低于HCs。对于中等活动度与LDA/缓解比较，ESR+CCDC88A模型较ESR单独显示改善但幅度有限的诊断性能，敏感性更高而特异性更低。因此，CCDC88A应视为需前瞻性独立验证的候选标志物，而非临床适用生物标志物。