基于噬菌体展示库筛选靶向涡虫新生细胞表面标志TSPAN-1的高亲和力scFv抗体及其结合特异性表征

《Biology》：Isolation and Characterization of a High-Affinity Anti-TSPAN-1 scFv Antibody from a Phage-Display Library for Planarian Neoblast Targeting

　　

背景：涡虫新生细胞（neoblasts）是负责全身再生的多能成体干细胞，但用于其特异性识别和分离的抗体工具仍然有限。本研究旨在利用噬菌体展示技术生成靶向TSPAN-1（tetraspanin-1，四跨膜蛋白1；一种新生细胞表面标志物）的高亲和力单链可变片段（scFv，single-chain variable fragment）抗体。方法：研究人员用与麦芽糖结合蛋白（MBP，maltose-binding protein）融合的TSPAN-1重组大胞外环（LEL，large extracellular loop）免疫小鼠，并构建了噬菌体展示scFv库（3.86 × 10⁷ CFU，colony-forming unit，菌落形成单位）。针对固定化的His-LEL进行了四轮生物淘选。通过ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验）、菌落PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）和DNA测序筛选阳性克隆。在已表征的克隆中，scFv-16显示出最高的表观亲和力。该克隆被亚克隆用于原核表达，包涵体蛋白经复性和纯化。结果：Friguet分析得出scFv-16与His-TSPAN-1结合的表观亲和常数（K_aff，apparent affinity constant）为4.20 × 10⁸ M^?1，对应解离常数（K_D，dissociation constant）为2.38 nM。Western blotting（蛋白质印迹）和immunofluorescence staining（免疫荧光染色）支持scFv-16对TSPAN-1的特异性。结论：成功生成了高亲和力抗TSPAN-1 scFv，为涡虫再生研究中的新生细胞识别和潜在分离提供了候选分子工具。

论文解读：基于噬菌体展示筛选靶向涡虫新生细胞TSPAN-1的高亲和力scFv抗体

多能干细胞（pluripotent stem cells，PSCs）是研究胚胎发育、细胞谱系定向和器官发生的重要体外模型，也是解析个体发育与衰老机制的关键工具。传统模式生物如Caenorhabditis elegans、Drosophila、zebrafish和mice中尚未鉴定出自然存在的成体多能干细胞；涡虫则具有丰富的成体干细胞群，统称为新生细胞（neoblasts，涡虫成体多能干细胞），其中克隆性新生细胞使涡虫具备全身再生和维持组织稳态的能力。因此，涡虫是研究成体动物如何长期维持干细胞多能性的独特模型。然而，涡虫新生细胞的短期体外培养已有进展，长期体外维持体系仍缺乏，严重阻碍其多能性调控机制研究和转基因工具开发。涡虫新生细胞标志物分为细胞内标志物和细胞表面标志物；经典细胞内标志物为Smedwi-1（PIWI-1），TSPAN-1（tetraspanin-1，四跨膜蛋白1；亦称P503s、C4.8或NET-1）是重要细胞表面标志物。TSPAN-1属于四跨膜蛋白超家族，具有四个跨膜域、短胞内环和两个不等长胞外环，其中位于第三和第四跨膜域之间的大胞外环（LEL，large extracellular loop）是主要功能区，并含A、B、C、D、E五个保守域，参与蛋白–蛋白相互作用、细胞黏附和信号转导。噬菌体展示技术（phage display）通过将单链可变片段（scFv，single-chain variable fragment）与噬菌体外壳蛋白融合展示，建立抗体表型与编码基因型的物理联系，可从庞大抗体库中快速富集高亲和力、高特异性scFv，并克服传统杂交瘤技术库多样性受限和开发周期长的不足。基于此，研究人员以TSPAN-1为靶点，构建鼠源免疫scFv噬菌体展示库，筛选抗TSPAN-1 scFv，以期为涡虫新生细胞识别和潜在分离提供候选分子工具。

研究人员开展了靶向涡虫新生细胞表面标志TSPAN-1的高亲和力scFv筛选与表征研究。研究人员以TSPAN-1的LEL为靶抗原，用重组MBP-LEL免疫小鼠，构建鼠源免疫scFv噬菌体展示库，并针对固定化His-LEL进行四轮生物淘选（bio-panning，利用靶抗原固定化从噬菌体库中富集特异性结合克隆的过程）；通过ELISA、菌落PCR和DNA测序鉴定阳性克隆；将候选scFv进行原核表达、包涵体（inclusion bodies，重组蛋白在不溶性聚集体中积累的形式）复性和纯化；以Friguet法测定表观亲和力；通过Western blotting（蛋白质印迹）和免疫荧光染色验证特异性。研究得出，scFv-16在已表征克隆中表观亲和力最高，K_aff为4.20 × 10⁸ M^?1，对应K_D为2.38 nM；Western blotting和免疫荧光染色支持其对TSPAN-1的特异性。该研究为涡虫新生细胞识别和潜在分离提供了候选分子工具，对涡虫再生研究中的新生细胞生物学和再生机制研究具有重要意义。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究人员以重组TSPAN-1 LEL为靶抗原，采用噬菌体展示技术构建鼠源免疫scFv库并进行四轮生物淘选；通过ELISA、菌落PCR和DNA测序筛选阳性克隆；对候选scFv进行原核表达、包涵体复性和纯化；以Friguet法测定表观亲和力；通过Western blotting和免疫荧光染色验证特异性。样本来源包括：Schmidtea mediterranea cDNA与HEK 293T细胞由Dr. Shoutao Zhang’s laboratory（Zhengzhou University）提供，HEK 293T细胞亦由Dr. Shoutao Zhang at Zhengzhou University提供；免疫用三只8周龄雌性SPF BALB/c小鼠购自Henan Experimental Animal Center（Zhengzhou, China）。

3.1 重组蛋白制备：研究人员从Schmidtea mediterranea cDNA扩增321 bp的TSPAN-1 LEL片段，构建pMAL-C5X-LEL并在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达MBP-LEL融合蛋白，经亲和层析纯化并以SDS-PAGE确认表达和纯度；同时构建pcDNA3.1-LEL并转染HEK 293T细胞瞬时表达His标签LEL蛋白（His-LEL，带多组氨酸标签的LEL蛋白），经亲和纯化并以SDS-PAGE评估产量和纯度。结论是获得了用于免疫的MBP-LEL和用于淘选的His-LEL两种重组抗原。

3.2 动物免疫与抗血清滴度评价：三只雌性BALB/c小鼠接受三剂 purified recombinant MBP-LEL免疫，末次加强后采集尾静脉血，以间接ELISA测定血清抗TSPAN-1抗体滴度；所有免疫小鼠均产生针对TSPAN-1的强多克隆抗体反应，mouse #3滴度最高，为1:320,000；在1:320,000稀释度下mouse #3的三重复OD450值与阴性对照相比显著更高（p < 0.05）。结论是重组MBP-LEL具有强免疫原性，mouse #3被选用于脾细胞采集和后续噬菌体展示scFv库构建。

3.3 噬菌体展示库构建：研究人员无菌采集mouse #3脾脏，提取总RNA并逆转录为cDNA，特异性扩增VH和VL基因，经琼脂糖凝胶电泳确认预期大小；将VH、VL和柔性连接肽片段通过SOE-PCR组装为全长scFv基因（约750 bp），与pCANTAB-5E phagemid载体经SfiI和NotI双酶切后连接并电转E. coli TG1；随机挑选9个克隆进行菌落PCR，均为阳性重组子，Sanger测序显示阅读框正确、无提前终止密码子，9个序列均唯一，平均核苷酸序列一致性为79.16%，提示所采样克隆并非来自单一亲本克隆；库容为3.86 × 10⁷ CFU。结论是成功构建了鼠源免疫scFv噬菌体展示库。

3.4 结合试验鉴定阳性克隆：研究人员针对真核表达的His-LEL进行四轮固相淘选，至第四轮获得108倍富集，噬菌体输出随轮次增加；第四轮后随机挑选60个单菌落进行菌落PCR，均显示约900 bp的单一条带，表明scFv插入片段完整；对60个克隆进行噬菌体ELISA，以辅助噬菌体M13-K07（无scFv插入）为阴性对照，克隆3、16和24的吸光度高于 cutoff（M13-K07均值 + 3 SD）；提取三个阳性克隆的重组phagemid并经NotI和SfiI双酶切验证，释放约750 bp插入片段；Sanger测序显示scFv-3、scFv-16和scFv-24全长分别为720 bp（编码240个氨基酸）、732 bp（编码244个氨基酸）和726 bp（编码242个氨基酸）；IgBLAST分析确认三个scFv的VH和VL域均含典型三个补体决定区（CDR，complementarity-determining region）和四个框架区（FR，framework region）。结论是获得三个与His-LEL结合的阳性scFv克隆，且结构符合典型抗体特征。

3.5 scFv的制备、纯化与结合分析：研究人员将克隆3、16和24的scFv基因分别克隆入pET-15b载体，转化E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达His标签scFv；SDS-PAGE确认scFv-3、scFv-16和scFv-24均表达，但三种蛋白均以包涵体形式积累；体外复性后经亲和层析纯化，SDS-PAGE显示预期分子量单一条带；BCA法测定蛋白浓度，ELISA评估三种scFv与His标签LEL的结合；以两种抗原浓度和Friguet法估算表观亲和常数，scFv-16表观亲和力最高，K_aff为4.20 × 10⁸ M^?1，对应K_D为2.38 nM，因此scFv-16被选用于后续分析。结论是获得高纯度重组scFv，并确定scFv-16具有最高表观亲和力。

3.6 scFv-16与TSPAN-1的结合分析：研究人员以scFv-16为一抗进行Western blotting，检测 purified recombinant antigens，scFv-16特异性识别MBP-LEL（51 kDa）和His-LEL（12 kDa）条带，而对对照MBP（46 kDa）无信号，表明其特异性识别TSPAN-1 LEL表位且不与MBP标签交叉反应；进一步以纯化scFv-16（1:1000稀释）为一抗检测Schmidtea mediterranea总蛋白，出现约28 kDa的单一条带，与涡虫TSPAN-1理论分子量一致；在涡虫组织全 mount 免疫荧光染色中，组织经固定、甲醇脱水和1% SDS透化后，scFv-16绿色信号与H3P（phospho-histone H3 Ser10，分裂新生细胞标志）阳性新生细胞红色信号重叠，省略一抗时未观察到特异荧光。结论是这些结果与scFv-16特异性结合涡虫新生细胞内源性TSPAN-1相一致。

讨论部分总结：抗体为基础的荧光激活细胞分选（FACS，fluorescence-activated cell sorting）和磁激活细胞分选（MACS，magnetic-activated cell sorting）已广泛用于从异质细胞群体中分离目标亚群，并推动干细胞生物学、再生医学、肿瘤微环境研究和发育生物学进展。涡虫新生细胞是研究组织稳态和器官再生的理想模型，但长期体外扩增且不丧失干性仍是主要挑战；克服该瓶颈需要分离高纯度、有活力的起始细胞群体。传统利用Hoechst 33342等DNA结合荧光染料富集新生细胞的方法常造成DNA损伤且分选纯度不理想；靶向特定细胞表面标志物的抗体分选可提高分离亚群纯度，并实现活细胞非破坏性富集，从而保留活力和增殖潜能。近期研究已鉴定跨膜蛋白TSPAN-1为涡虫新生细胞特异性表面标志物，将单个TSPAN-1阳性细胞移植入致死照射涡虫可重建所有组织并再生完整个体。噬菌体展示技术因操作简便和快速筛选能力而提供高效抗体工程平台；本研究构建了针对TSPAN-1的鼠源免疫scFv噬菌体展示库并筛选特异性抗TSPAN-1 scFv，长期目标是开发涡虫干细胞体外分离的新工具。尽管TSPAN-1 LEL溶剂暴露且富含亲水残基，但在E. coli异源表达时易聚集为包涵体；研究人员利用MBP标签的增溶特性构建了两种重组体：MBP-LEL用于免疫，His-LEL用于噬菌体展示生物淘选。MBP-LEL因高表达产量和低成本被选为免疫原，His-LEL作为筛选scFv噬菌体库的靶抗原进行四轮淘选；该策略在四轮中使噬菌体输出增加约100倍，并获得多个候选抗TSPAN-1克隆。Friguet法测定显示scFv-16与His-LEL结合的表观亲和常数K_aff为4.20 × 10⁸ M^?1（对应K_D为2.38 nM），在已表征克隆中最高；对于来自免疫库的未成熟scFv而言，这一低纳摩尔亲和力令人鼓舞，该克隆有望用于Western blotting和免疫荧光等标准抗体检测。需要注意的是，本研究的免疫荧光染色在固定、甲醇脱水和1% SDS透化的组织上进行，因此这些数据不能证明scFv-16与完整细胞上天然构象TSPAN-1的胞外域结合，仍需在活细胞上进一步验证；其在FACS和MACS等活细胞应用中的潜力将在未来研究中评估。scFv-16在E. coli中重组表达仍形成包涵体，尽管可通过体外复性回收可溶性scFv，但该过程可能部分影响抗原结合活性，其结合亲和力还可通过系统的体外亲和成熟进一步提高；因此未来研究应探索真核表达平台并结合噬菌体亲和成熟，以进一步优化所选抗体的亲和力和生物学功能。

研究结论翻译：长期体外培养新生细胞并维持其干性仍是重大挑战，而抗体分选为活细胞非破坏性富集提供了有效策略。本研究构建了靶向TSPAN-1（涡虫新生细胞细胞表面标志物）的鼠源免疫scFv噬菌体展示库。由于TSPAN-1大胞外环在E. coli异源表达时易形成包涵体，研究人员制备了MBP融合蛋白（MBP-LEL）作为免疫原，并制备了真核表达系统产生的His标签LEL蛋白（His-LEL）作为生物淘选抗原。四轮淘选使噬菌体输出增加约100倍，并获得若干候选抗TSPAN-1克隆；在已表征克隆中，先导克隆scFv-16经Friguet法测得与His-LEL结合的表观亲和常数（K_aff）为4.20 × 10⁸ M^?1（对应K_D为2.38 nM）。对于来自免疫库的未成熟scFv而言，这一纳摩尔亲和力令人鼓舞，scFv-16有望用于Western blotting和免疫荧光等标准抗体检测；其在FACS和MACS等活细胞应用中的潜力将在未来研究中评估。