狼狗杂交：种群结构混淆遗传归属与杂交分类

《iScience》：Wolf-dog hybridization: Population structure confounds genetic assignment and hybrid classification

　　

Highlights
• 忽视种群结构可能会产生杂交的假信号
• 我们的框架直接根据常规监测数据推断狼群结构
• 针对特定簇的 STR 筛选可锁定模糊个体以供 SNP 验证
• 在受监测的捷克狼群中未发现正在进行的狼犬渗入证据

Summary
准确的杂交检测对保护工作日益重要，然而，当结构种群被当作同质种群分析时，基因分配可能会受到严重偏见影响。这一问题在重新定居系统中尤为相关，因为来自分化源种群的个体在此相遇并发生混血。我们提出并评估了一个与监测兼容的框架，该框架在测试杂交之前考虑了种群结构，且无需依赖研究区域以外的参考种群。利用捷克（中欧分化谱系的接触区）四年来的常规狼群监测数据，我们表明忽视种群结构可能会夸大混血程度并产生杂交假信号。结合特定种群的校准和独立验证解决了模糊的分配问题，并未提供受监测狼群中存在正在进行的狼犬渗入的证据。我们的结果表明，解释杂交信号时必须明确考虑种群结构，并为其他结构种群野生动物保护监测提供了一个实用框架。

Graphical abstract
图形摘要

Introduction
杂交长期以来被认为是一个重要的产生新异的进化过程。然而，在保护背景下，它也可能代表对野生种群基因完整性和长期持续性的重大威胁。当野生物种与数量大得多的近缘家养形式发生接触时，这种风险尤为显著，从而允许不对称渗入和潜在的基因淹没。因此，大量研究工作致力于监测多种类群的杂交。尽管做出了这些努力，杂交检测仍然是保护遗传学中最具挑战性的分析问题之一。

家养动物与其野生祖先的分化相对较晚，通常在最近几千年或几万年内，这不足以让基因组的大部分区域发展出互源单系。因此，共有的祖先多态性可能持续存在并掩盖近期混血的信号。此外，容易检测到的第一代（F1）杂交个体通常很少见，大多数情况下仅在杂交广泛或持续进行的条件下才能检测到。在大多数自然系统中，渗入通过重复回交进行，逐渐稀释家养祖先基因并进一步使混血个体的识别复杂化。检测混血个体的这些挑战也因常规监测通常基于非侵入性或环境样本（如粪便、毛发或唾液）而加剧，这些样本通常具有低数量和质量。因此，尽管高通量测序方法取得了巨大进步，经典监测方法仍然主要依赖于短串联重复（STR）位点。这些因素共同使得杂交检测对分析假设和标记选择特别敏感。

这些挑战在涉及家养 - 野生杂交的系统尤为明显。灰狼（Canis lupus）与家犬（C. l. familiaris）之间的杂交是大型食肉动物中人类引起的杂交研究最广泛的例子之一，并在欧洲各地被越来越多地报告。它似乎在地中海地区最为显著，这些地区以大量流浪犬种群为特征。然而，即使在流浪犬数量有限的地区，由于狼群种群的持续人口和空间扩张，以及随之而来的狼犬相遇机会增加，杂交风险也在增加。狼犬杂交引起了各界的广泛关注，从研究、政策制定到媒体，这产生了需要对涉及可靠杂交确定方法的稳健科学数据的需求。在 Europe，狼犬杂交不仅是生物问题，也是治理问题，因为其分类会影响法律地位、保护框架下的报告以及管理决策，有时可能产生强烈的政治影响。例如，在斯洛伐克，据称杂交个体的存在是改变狼保护状态和重新确立狩猎的主要理由之一。最近的政策导向综述强调，缺乏共享的、可操作的狼犬杂交定义以及缺乏标准化诊断标准阻碍了协调监测和政策实施。由于形态学鉴定杂交个体被证明不足够，需要分子方法来可靠区分狼、狗及其杂交个体。

多种方法已应用于狼犬杂交检测，使用了广泛的遗传标记，最常见的是 STR、线粒体 DNA（mtDNA）片段和单核苷酸多态性（SNP），并结合了不同的分析框架和软件（参见 Dziech 的综述了解所用方法）。虽然这些研究大大推进了我们对杂交动态的理解，但大多数研究是在基因上相当同质的种群中进行的，或者对分析数据集中的遗传结构关注有限。相反，来自不同狼种群发生二次接触地区的研究很少，评估这些地区的杂交可能具有挑战性，因为种群结构会影响杂交测试并导致错误结果。具体来说，野生种群之间的混血可能被误解为家养渗入，导致假阳性杂交分配率升高或掩盖真正的杂交个体。

捷克就是这样一个地区，它位于三个狼种群的十字路口：中欧低地种群、喀尔巴阡种群和阿尔卑斯种群（根据 Hindrikson 等人）——形成了一个具有不同程度种群混血的个体镶嵌体。这种复杂的种群结构对杂交测试构成了特别具有挑战性的场景。由于捷克流浪犬数量少，预期杂交风险微乎其微，目前仅报告了一例杂交案例。然而，随着狼群种群的快速扩张，不应低估杂交对其基因完整性构成的威胁。因此，这种情况提供了一个机会，以评估在三条基因分化的狼谱系混血背景下常用杂交检测方法的可靠性。

在本研究中，我们旨在（1）建立一个保守的、与监测兼容的狼犬杂交检测工作流，该工作流考虑种内狼群结构，且无需依赖研究区域以外的外部参考狼群，以及（2）将此工作流应用于捷克狼群，以评估种群结构如何影响杂交推断并估计当前近期狼犬杂交的频率。为实现这些目标，我们使用基因监测中常用的 STR 标记作为初步筛选工具，随后针对 STR 分配模糊的个体使用设计用于狼犬混血检测的 SNP 面板进行定向确认。

Results
扩增成功率、物种鉴定和最终数据集
在四个狼年期间，总共收集了 2,413 个样本。其中，1,245 个（51.6%）样本达到了至少 13 个成功扩增的 STR 位点的质量阈值，这是可接受的共识基因型所需的标准。1,168 个未成功的样本未达到质量阈值或包含多个个体的遗传信息。成功基因分型的样本比例因样本类型而异，从杀死拭子（39.8%）、毛发样本（43.8%）、尿液样本（47.9%）、粪便（54.7%）、其他样本（57.6%）和血液样本（80%）到组织（88.5%）。在 1,245 个成功扩增的样本中，60 个（4.8%）和 41 个（3.3%）在聚类分析中被识别为来自狐狸和狗，并予以排除。进行身份分析后保留了总共 380 个个体，构成了最终数据集 D1。

敏感性分析
未预先考虑种群结构进行的分析在不同方法中产生了不一致的分配结果。数据集 D1 和对比狗群的 STRUCTURE 分析显示，存在两个簇（K = 2）的支持度最高，其中大部分狼与狗聚类或显示出不同程度的狼犬混血。类似地，簇数量较高的某些结果（图 1A 中 K = 2 和 K = 3）未能可靠区分狗和狼。NewHybrids 也将一些狼错误分类为纯种狗或将其归入各种杂交类别（图 1B）。相反，在主成分分析（PCA）图中，狗和狼被清晰区分（图 1C）。

Figure 1 未解决种群结构问题而使用完整数据集 D1 进行分析的结果
（A）K2–K3 的 STRUCTURE 结果：每一列代表一个个体，颜色代表不同的簇。每列中颜色的比例表示个体分配到簇的概率（q）。
（B）NewHybrids 结果：每一列代表一个个体，六种颜色代表 NewHybrids 区分的六种可能杂交类别。每列中颜色的比例表示个体属于每种杂交类别的后验概率（p）。
（C）PCA 结果：每个点代表一个个体，点的颜色表示个体的预定类别。该图使用 R 语言（版本 4.2.1）中的 ggplot2（版本 4.0.3）和 adegenet（版本 2.1.11）包创建，并在 Inkscape（版本 1.4.2）中编辑。

种群结构
D1 数据集的 STRUCTURE 分析显示对两个种群簇（K2）的支持度最强。基于 K2 的结果，应用 0.8 阈值将 275 个个体分配到簇（此后称为簇 C1），84 个到另一个（此后称为簇 C2），剩余的 21 个显示出混合祖先（图 2）。

Figure 2 数据集 D1 中的种群结构
（A）K = 2 的 STRUCTURE 结果。每一列代表 380 个个体中的一个，两种颜色代表两个种群簇（红色 = 簇 C1，绿色 = 簇 C2）。每列中两种颜色的比例表示个体分配到两个种群簇的概率（q）。
（B）两个簇的地理分布。每个点代表一个个体（其第一个有可用坐标的样本；没有已知坐标的个体未描绘），两种颜色代表两个种群簇（红色 = 簇 C1，绿色 = 簇 C2），每个饼图中的比例表示个体分配到两个种群簇的 q 值。该图使用 R 语言中的 ggplot2 包创建，并在 Inkscape 中编辑。底图取自 rnaturalearth 包（版本 1.1.0）。

阈值确定
使用模拟基因型运行的 STRUCTURE 在两个种群簇中均显示对 K2 的最高支持度。模拟 BC1W 的最高 qw 分数在簇 C1 中为 0.915（图 3A），在簇 C2 中为 0.9108（图 3D）。使用这些 BC1W 阈值，100 个模拟狼基因型中有 13 个和 10 个分别被错误识别为潜在杂交个体。没有任何模拟杂交类别被识别为纯种狼，表明 II 类错误率为 0%。

Figure 3 使用模拟基因型数据集（亲本类（狼和狗）和杂交类（F1、F2、BC1W 和 BC1D））进行分析的结果，针对簇 C1（A–C）和簇 C2（D–F）
（A 和 D）簇 C1（A）和簇 C2（D）K = 2 的 STRUCTURE 结果：每一列代表一个个体，两种颜色代表两个簇。每列中颜色的比例表示个体分配到两个簇的概率（q）。虚线显示区分纯种狼的阈值，该阈值基于此分析结果设定。
（B 和 E）簇 C1（B）和簇 C2（E）的 NewHybrids 结果：每一列代表一个个体，六种颜色代表 NewHybrids 区分的六种可能杂交类别。每列中颜色的比例表示个体属于每种杂交类别的后验概率（p）。虚线显示区分纯种狼的阈值，该阈值基于此分析结果设定。
（C 和 F）簇 C1（C）和簇 C2（F）的 PCA 结果：每个点代表一个个体，点的颜色表示个体的预定亲本或杂交类别。该图使用 R 语言中的 ggplot2 和 adegenet 包创建，并在 Inkscape 中编辑。

当在 NewHybrids 中分析模拟基因型时，模拟 BC1W 的最高 pw 分数在簇 C1 中为 0.9599（图 3B），在簇 C2 中为 0.9484（图 3E）。使用这些阈值，100 个模拟狼基因型中有 17 个和 15 个分别被错误识别为潜在杂交个体。

本研究拟议并评估了一个面向监测的保守框架，用于在具有遗传结构分化的种群中检测狼犬杂交个体（图6）。捷克共和国正是此类情形，因为它位于分化的狼种群的交汇处，产生出具有混合祖源基因型的狼，若未考虑种群结构，这些基因型可能被误判为狼犬渗入。因此，我们采用了一个依次进行的多步骤工作流程，该流程纳入种内结构因素、应用基于保守模拟校准的阈值，并使用独立的标记系统对存疑个体进行验证。该框架旨在与常规监测兼容，并避免依赖研究区域之外的外部"纯血狼"参考种群，同时仍能通过保守筛查和针对性验证实现可靠的杂交推断。通过对比不纳入种群结构因素的分析与针对特定结构的分析，本研究展示了种群结构如何影响接触带中的杂交推断，并为在监测数据集中估计近期狼犬杂交提供了一个实用的工作流程。

我们的阈值策略有意采用保守设计，旨在最大限度地减少II类错误，即将具有混合祖源的个体误判为纯血狼。这一目标适用于早期预警监测，因为在这些场景中，漏检真正的杂交个体可能带来重大保护或监管后果。我们使用HYBRIDLAB模拟，阈值源自最似狼的杂交类别（BC1W），该类别预计是最难被检测到的。因此，筛查步骤预计会将部分纯血狼标记为潜在混合个体。这一权衡在我们的模拟数据集中显而易见，其中10%至20%的模拟纯血狼未达所设定的阈值。另一方面，没有一只模拟的F1、F2或BC1W个体被误判为纯血狼，实现了预期的0% II类错误率。在实际监测中，这样的设计不可避免地会增加可疑个体的数量，如果筛查结果未经验证便被解读，则可能高估杂交现象。

尽管STRUCTURE和NewHybrids产生的筛查结果总体一致，但NewHybrids识别出的未达到纯血狼标准条件的个体数量略多于STRUCTURE。STRUCTURE和NewHybrids都是基于贝叶斯、MCMC算法的程序，但它们评估杂交的方式不同，这可能导致被识别为潜在混合个体的数量不同。对于每个个体，STRUCTURE估计其基因组中最能被各遗传簇解释的比例。然后，通过将分配阈值应用于狼簇的成员资格来间接推断杂交状态。相比之下，NewHybrids是专门为杂交分类而设计的。它评估个体的多位点基因型与预定义类别的预期模式之间的匹配程度，并返回属于每个类别的后验概率。重要的是，阈值不能在不同研究之间直接转移，也不能在两种方法之间直接比较。它们强烈依赖于标记的数量和信息量，理想情况下应使用模拟（如HYBRIDLAB）进行校准，以控制误分类率。在狼犬系统中，基于模拟的评估进一步表明，提高标记分辨率通常会增加分配信心并允许采用更严格的阈值，同时也指出回交和渗入个体仍然是最难可靠识别的类别。因此，在保守设置下，NewHybrids可能会将更多的个体标记为非纯血，但程序间的差异也可能反映了参考亲本群体中残留的结构差异。

为验证被STR筛查标记为混合祖源的个体，我们应用了Harmoinen等人开发的狼犬祖源信息型SNP面板，该面板专门设计用于弥合全基因组推断与基于非侵入性样本的常规监测之间的差距。所选标记在狼和犬之间表现出强烈的等位基因频率分化，并能可靠地区分亲本个体和早期世代杂交个体。在我们的工作流程中，这一SNP确认步骤作为针对性的、更高分辨率的测试，仅应用于STR阈值以下的个体子集，使我们能够区分真正的犬渗入和保守STR筛查设计中预期的"假阳性"。重要的是，这并不减损STR在此情境中的价值。与专门为杂交检测开发的SNP面板不同，常规监测中的STR基因分型需要服务于多种目的，从物种鉴定、个体识别、亲缘关系测试到群体遗传学和种群结构分析。当需要时效性管理决策时（通常在数小时至数天内），STR面板还具有成本效益优势，并且对非侵入性样本典型的低DNA含量和DNA碎片化具有较强的稳健性。

线粒体单倍型提供了额外的独立证据，为STR筛查标记的个体提供了背景信息。

由于mtDNA反映母系遗传，它本身无法确认或排除杂交，但对于评估可疑个体的母系谱系是否与研究区域预期的单倍型池一致是有用的。在我们的数据集中，除一个个体外，所有成功扩增的个体都携带了此前报道的典型狼单倍型。本研究中检测到的最常见单倍型w1存在于东北欧洲的狼中，也是中欧低地狼种群中最常见的单倍型，其分布区域延伸至捷克。w6和w14单倍型是喀尔巴阡山脉和迪纳里-巴尔干种群的典型特征，其中前者出现在捷克东部。w22单倍型是高加索种群的典型特征，其成员已扩散并混入捷克西南部中欧低地种群。w23单倍型在迪纳里-巴尔干和高加索种群中均有报道。这些检测到的单倍型暗示这些个体的本地起源，并未表明远距离扩散。因此，mtDNA结果支持这样的解读，即大多数STR标记的可疑个体代表嵌入区域基因池中的狼，而不是母系祖先异常的近迁入个体。尽管在另一个个体中识别出的w19单倍型在东部欧洲的狼中有报道，但在家犬中也常被检测到。在本研究的380个分析个体中，仅有一例经SNP验证确认为近杂交个体，表明捷克近期狼犬杂交的流行率较低。这一发现与该国流浪犬数量较少相一致，因为欧洲范围内报告的高杂交率通常与大量流浪犬相关，而低杂交率则与其缺失有关。此外，狼的狩猎会扰乱狼群种群动态，导致同种配偶缺乏，可能导致狼犬杂交。灰狼被列为严格保护物种，且根据捷克国民议会自然与景观保护法（第114/1992号）和狩猎法（第449/2001号）禁止狩猎，这可能是捷克杂交率较低的原因。

被鉴定为杂交的单一个体在不同分析中显示出不同程度的狼犬混合，但总体上与犬比较簇更为相似，而与狼簇两者均较不相似。在地中海地区流浪犬密度较高的地区，也有类似回交到犬的案例报道，而这种情况在捷克并不典型，因为该国流浪犬受到管控。该个体还携带mtDNA单倍型w19，该单倍型在狼中有报道，但在家犬中也常被检测到，这与犬关联的母系谱系相符。重要的是，该个体仅在克尔科诺谢地区一个高度旅游的区域被检测过一次，在随后的季节里（直到2025年秋季），尽管在更大范围内进行了持续密集监测，也未再被发现。此类犬关联个体可能通过多种途径产生，包括近期回交到犬，或在某些情况下由人工繁育产生；然而，现有证据无法让我们在本例中区分这些可能性。总之，这些观察结果与一个孤立的、非复发的事件一致，涉及一个具有狼祖先的犬关联个体，并不表明该区域正在持续杂交或建立了流浪混合谱系。

结论

我们的结果表明，基于常规STR监测的狼犬杂交推断可能受到接触区系统中种内种群结构的强烈干扰。忽略种群结构的分析可能错误地将狼分配为犬或杂交个体，并夸大表观混合程度，而使用模拟进行结构特异性校准提供了一种透明控制错误率并保守解读"可疑"分配的方法。通过结合簇特异性阈值化（STRUCTURE和NewHybrids）与独立标记系统（mtDNA和SNPs）验证，我们的工作流提供了一种适用于监测且成本效益高的杂交评估框架，不依赖于研究区域外的外部参考狼种群，并明确纳入对疑似杂交个体的独立验证。应用这一框架，我们发现监测狼种群中没有持续狼犬渐渗的证据；唯一确认的非狼分配涉及一个在研究期间仅检测到一次的犬关联回交个体。

我们的研究支持分层方法，其中STR基因分型保留了对大规模监测和快速筛选的高操作价值，而标准化SNP检测则为有限数量的模糊案例提供了可靠的确认。在杂交分类具有管理后果，且随着再殖民化进程推进，狼谱系间的种群结构和混合程度预计将增加的情况下，这类可重复的管道至关重要。

研究的局限性

在解释来自监测数据集的杂交估计时，应考虑几个局限性。我们的工作流旨在检测常规监测条件下近期的狼犬杂交和早期代回交，但低水平的渐渗，尤其是晚期回交，在没有全基因组数据的情况下，仍然难以与背景变异区分。此外，尽管SNP面板为模糊案例提供了标准化的确认步骤，但其性能仍取决于非侵入性样本中DNA的质量和基因型的完整性。最后，由于分配阈值因标记和数据集而异，如果标记集或比较犬群的组成发生实质性变化，应重新校准。同样，我们的分析表明，家犬中的分配模式也取决于所分析数据集的组成和用于比较的特定狼种群。这一观察结果可能反映了狼和犬之间广泛共享的遗传变异，以及家犬品种异质的人口历史，包括奠基者效应、近亲繁殖、遗传漂变和不同水平的历史狼祖先。由于我们的犬数据集旨在捕捉广泛的家犬多样性，而非代表特定的犬种群或品种，我们不认为这些模式对于评估向犬的渐渗具有信息性。

资源可用性

主要联系人

关于进一步信息和资源的请求应提交给主要联系人Barbora ?erná Bolfíková（[e-mail]），并将由她满足。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

- 本研究产生的STR和SNP数据包含在数据S1文件中，并自发表之日起公开可用。
- 本文不报告原始代码。
- 重新分析本文报告数据所需的任何附加信息均可向主要联系人索取。

致谢

我们感谢许多致力于自然之友捷克肉食动物保护计划的志愿者和专业人员、捷克共和国自然保护局、捷克生命科学院布拉格大学、布伦大学、克尔科诺谢国家公园和舒马瓦国家公园管理局在野外采集样本和实验室处理样本方面所做的努力。我们感谢Berardino Cocchiararo、Gregor Rolshausen和森根堡野生动物遗传学中心实验室团队进行SNP分析。本研究由捷克共和国技术署通过"环境与生活"计划下的"狼遗传监测"项目（SS07010447）、捷克生命科学院布拉格大学内部拨款局（IGA 20253125）、跨边境合作德国/巴伐利亚-捷克2021-2027（BYCZ01-001）、跨边境合作德国/萨克森-捷克2014-2020（100686869）和2021-2027（100400831）、捷克共和国环境部（CZ.05.4.27/0.0/0.0/20_139/0013781）以及中央欧洲跨边境合作2021-2027（LECA CE0100170）资助。计算资源由e-INFRA CZ项目（ID：90254）提供，该项目由捷克共和国教育、青年和体育部支持。

作者贡献

概念化：B.?.B.、P.H.、E.C.和K.E.；方法学：B.?.B.、P.H.、E.C.和K.E.；调查：E.C.、P.M.、N.T.和J.?.；数据管理：E.C.、P.M.、N.T.和J.?.；正式分析：E.C.、B.?.B.、K.E.和P.H.；资源：J.J.、M.K.、A.V.、C.N.、P.H.和B.?.B.；资金获取：B.?.B.、P.H.、J.J.、M.K.、A.V.和C.N.；监督：B.?.B.和P.H.；撰写——初稿：B.?.B.、E.C.和K.E.；撰写——审阅和编辑：所有作者。

利益声明

作者声明没有竞争利益。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
--- | --- | ---
QIAamp? Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | Cat#51604
NucleoSpin? DNA Stool Kit | Macherey-Nagel | Cat#740472.50
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) | Geneaid | Cat#GB100
DNeasy? Blood and Tissue Kit | QIAGEN | Cat#69506
Genomic DNA Mini Kit (Tissue) | Geneaid | Cat#GT100
Multiplex PCR Plus Kit | QIAGEN | Cat#206152

已存档数据

狼STR基因型 | 本研究 | 数据S1
狼SNP基因型 | 本研究 | 数据S1

寡核苷酸

狼STR面板 | 本研究，Hulva等人 | 表S1
狼mtDNA控制区引物（Thr-L15926，DL-H16340） | Vilà等人 | https://doi.org/10.1046/j.1365-294x.1999.00825.x
SNP狼犬杂交面板 | Harmoinen等人 | https://doi.org/10.1186/s12864-021-07761-5

软件和算法

ggplot2（版本4.0.3） | Wickham | https://github.com/tidyverse/ggplot2/
adegenet（版本2.1.11） | Jombart | https://github.com/thibautjombart/adegenet
R 4.2.1 | R核心团队 | https://www.r-project.org/
Inkscape 1.4.2 | Inkscape开发者 | https://inkscape.org/
rnaturalearth（版本1.1.0） | Massicotte和South | https://github.com/ropensci/rnaturalearth
Geneious Prime? 2025.2.2 | Geneious | https://www.geneious.com/
Microsatellite Plugin | Geneious，Kearse等人 | https://www.geneious.com/plugins/microsatellite
STRUCTURE 2.3.4 | Pritchard等人 | https://web.stanford.edu/group/pritchardlab/structure_software/release_versions/v2.3.4/html/structure.html
STRUCTURE Selector | Li和Liu | https://lmme.ac.cn/StructureSelector/
ΔK方法 | Evanno等人 | https://doi.org/10.1111/j.1365-294X.2005.02553.x
Cervus 3.0.7 | Kalinowski等人 | https://www.fieldgenetics.com/pages/aboutCervus_Overview.jsp
allelematch（版本2.6.0） | Galpern等人 | https://github.com/cran/allelematch
NewHybrids 1.1 | Anderson和Thompson | https://github.com/eriqande/newhybrids
HYBRIDLAB 1.1 | Nielsen等人 | https://doi.org/10.1111/j.1471-8286.2006.01433.x
Standard BioTools? SNP Genotyping Analysis Software 1.0.2 | Standard BioTools | https://standardbio.com/products-services/software/

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方法详情

研究设计和分析框架

本研究分析框架反映了常规遗传监测的条件，在这种条件下，目标狼种群的遗传结构和混合组成通常在分析时未知。尽管杂交研究通常依赖于预先定义的参考狼种群，代表推定的"纯种"狼，但这种方法假设监测狼种群的祖先已知。这一假设在再殖民化种群和二次接触区中可能不成立，因为个体可能来自多个遗传分化的狼种群。因此，没有使用代表推定"纯种"狼种群的外部参考数据集。所有狼样本均在捷克和斯洛伐克西部采集，遗传数据作为国家狼监测项目和捷克-斯洛伐克跨境研究的一部分生成。家犬被纳入作为比较组，以实现杂交推断。这些包括在狼监测中采集且被鉴定为犬的样本个体，以及包括牧犬和猎犬在内的若干犬种，这些犬种最可能出现在狼犬共存区域。捷克斯洛伐克狼犬作为一种有狼渐渗记录的品种也被纳入，以控制狼犬分配分析中潜在的中间基因型。这种设计使我们能够在不假设狼种群起源先验知识或不依赖研究区域外预先定义的参考狼种群的情况下，评估现实监测条件下的杂交情况。

STR标记被用作主要筛选工具，反映了它们在遗传监测中的常规应用，以使用以下描述的分析方法评估狼犬混合类别。对于表现出模糊分配的个体，我们应用了专门开发的SNP杂交面板，作为有针对性的确认步骤（见附图6了解工作流概述）。

样本采集

本研究使用的样本在四个连续的狼年（2020/2021、2021/2022、2022/2023、2023/2024）期间采集，每个狼年从一个日历年5月1日开始，到次年4月30日结束。样本采集由训练有素的志愿者、护林员和捷克共和国自然保护局、自然之友肉食动物保护计划、布伦大学林业与木材技术学院、捷克生命科学院布拉格大学环境科学学院、舒马瓦国家公园和克尔科诺谢国家公园的动物学家在常规狼监测中进行。采样主要是非侵入性的，包括粪便、毛发、尿液、发情血和唾液痕迹。组织样本来自死亡动物，由捷克共和国自然保护局提供，该机构被授权处理此类材料。在保护区内的采样由授权工作人员或与相关保护区管理局合作进行，所有采样活动均遵守国家法规。未为研究目的捕捉、处理或惊扰任何动物。

样本储存在-20°C的96%乙醇中，并在捷克生命科学院布拉格大学热带农业科学学院的分子遗传学实验室中处理，该实验室根据1999年第166号法律第48(1)(i)条和相关欧洲法规（第1069/2009号(EC)法规和第142/2011号(EU)委员会法规）获得了动物材料存储和使用的批准（第CZ 11712934号）。

共采集了2,413个样本，包括1,496份粪便、430份屠宰-拭子、267份尿液样本、121份毛发样本、40份发情血样本、26份组织样本和33份其他样本（猎物的毛发和组织、唾液、呕吐物、蜱虫）。

比较犬数据集由先前发表的已知家养犬种参考基因型组成，曾用于早期研究。其中包括与研究区域相关的牧犬和猎犬品种，以及捷克斯洛伐克狼犬，该品种有记录的狼血统。

**样品处理**

使用商业试剂盒并按制造商方案从样品中提取DNA。对于粪便样品，使用样品顶层180–220毫克进行提取，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）或NucleoSpin DNA Stool Kit（Macherey-Nagel）。尿液样品先按30:66:3的比例用96%乙醇和3M醋酸钠稀释，以5,500 × g、4°C离心60分钟，随后使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）进行处理。静脉血使用Genomic DNA Mini Kit（Blood/Cultured Cell）（Geneaid）提取DNA，凝固血液使用DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN）提取。其他所有样品类型使用DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN）或Genomic DNA Mini Kit（Tissue）（Geneaid）。杀蝇棒从杆上取下并切碎。组织样品切成不超过25毫克的碎片，毛发样品修剪至仅保留含毛囊的片段，蜱虫干血碎片成小块。唾液和呕吐物样品以5,500 × g离心30分钟，从干燥沉淀物中提取DNA。裂解缓冲液的用量根据样品体积和溶解性进行调整。洗脱时使用30–100微升相应的洗脱缓冲液。

所有样品通过多管法使用Multiplex PCR Plus Kit（QIAGEN）进行聚合酶链反应（PCR）扩增，扩增包括20个STR位点和性别决定基因amelogenin（附表S1）的面板。方法与Hulva等人描述的相同，唯一的变化是移除了FH2017位点，因为其扩增成功率低。每个样品扩增2–5次重复，直至达成共识基因型。按照Tumendemberel等人的方法，杂合等位基因要求在至少两个独立PCR重复中出现，纯合等位基因要求在至少三个独立PCR重复中出现，方可纳入共识基因型。无法根据STR基因型可靠地判定为纯种狼的个体（见下文详细说明）需接受额外分析以评估其潜在混血血统。对于这些样品，使用Thr-L15926（5′-CAATCCCCCGGTCTTGTAACCC-3′）和DL-H16340（5′-CCTGAAGTAGAAACCAGATG-3′）引物扩增线粒体控制区高变区的左侧域（D-loop），遵循Hulva等人的方法。这些个体还在一个96个SNP面板上进行基因分型，该面板专门设计用于检测狼-犬杂交。使用微流控芯片方法在Biomark HD系统（Standard BioTools，原Fluidigm）上进行扩增。

**基因型及未成功扩增样品的移除**

STR数据在Geneious Prime 2025.2.2（www.geneious.com）中使用Microsatellite Plugin进行编辑和分箱。等位基因调用结果经人工检查，模糊峰、峰不平衡、支链产物以及扩增不一致的位点均作为缺失数据处理。纯合基因型仅在重复扩增同一等位基因后才被接受，杂合基因型要求两个等位基因均被重复观察到。无法一致评分的位点从共识基因型中排除。仅在20个STR位点中至少13个（即标记集的≥65%）获得可靠共识基因型的样品才被保留用于个体识别和下游分析。

**物种判定**

自2014年以来，物种判定已作为国家级狼监测的常规内容，每年使用STRUCTURE 2.3.4中实现的贝叶斯聚类进行分析。此常规筛选步骤旨在区分狼与其他犬科动物，并在下游分析前排除明确非狼样品。每年狼监测年度结束时，所有质量达标的共识基因型与狐狸（N = 5）、豺（N = 2）、各种犬种（N = 36）的参考基因型以及代表中欧低地（N = 36）、喀尔巴阡（N = 36）和阿尔卑斯（N = 25）狼群的狼基因型一同进行分析。这三个狼种群代表目前为捷克狼分布和混合动态提供来源的主要种群。在本研究背景下，这些比较基因型仅用于常规物种判定和质量控制，未作为后续杂交分析中的参考种群。

所有比较基因型均使用本研究中的20个STR标记构建，唯独阿尔卑斯狼的基因型仅包含12个位点（见附表S1）。STRUCTURE分析使用无混合和等位基因频率相关模型。选择无混合模型是因为此初步分析的目标是将样品分配至主要犬科群体，而非推断混合比例；选择等位基因频率相关模型是因为已有研究表明该模型能改善亲缘关系密切的群体和物种间的分配性能。与本研究中所有STRUCTURE分析相同，对K = 1–5运行五个重复，预热迭代200,000次，随后运行800,000次迭代，五个重复的结果在STRUCTURE Selector中汇总，并使用ΔK方法确定最支持的聚类数。被分配至犬或狐集群的个体进一步被排除，以便下游分析聚焦于可能存在混合的狼个体。

**唯一个体的识别**

使用Cervus 3.0.7中的同一性分析筛选狼多位点基因型以匹配同一个体，要求至少八个位点匹配，最多允许七个不匹配。允许的不匹配数基于在R的allelematch包（版本2.6.0）中计算的最优等位基因Mismatch值。所有基因型匹配的情况均使用可用元数据（原始数据、采样日期和地点）进行验证，确认一致且最终不匹配数不超过四个的情况用于构建共识基因型。对于下游杂交分析，每个个体保留一个共识基因型，对应该个体在四个分析狼监测年度（2020/2021–2023/2024）中的首次检测记录。这些基因型构成用于杂交分析的数据集（以下简称数据集D1）。

**敏感性分析**

由于监测实践中杂交检测常在没有预先评估种内结构的情况下对合并数据集进行，我们首先将数据集D1整体作为基线（"无结构"）情景进行分析。此分析旨在评估忽略种群结构对狼-犬分配和杂交分类结果的影响程度，并与随后应用的有结构工作流程进行直接比较。数据集D1整体（N = 380）与比较犬（N = 67）在STRUCTURE中使用混合和等位基因频率相关模型进行分析。选择这些模型是因为当代欧洲狼群经历二次接触和混合，且等位基因频率相关模型能提高亲缘关系密切群体间细微种群结构的分辨率。相同数据在NewHybrids 1.1中使用均匀先验、预热200,000次迭代后运行1,000,000次迭代进行分析（与本研究中其他NewHybrids分析设置相同）。结果还使用R中adegenet包（版本2.1.11）实现的PCA进行可视化。该方法使我们能够量化仅种群结构本身产生表观混合信号的程度。

**种群结构分析**

在杂交分析之前，我们对经验狼数据集D1的种群结构进行了表征，因为分化狼群间的混合可能产生类似狼-犬杂交的分配模式，如上述敏感性分析所示。因此，此步骤的目的并非将个体分类为纯种或混血，而是识别数据集中存在的主要狼遗传背景，并为后续阈值校准定义种群特异性校准组。

使用STRUCTURE的混合和等位基因频率相关模型推断种群结构，通过ΔK确定最高支持的聚类数（以下简称种群聚类）。分配概率（q）≥0.8至单一种群集群的个体被视为该种群集群的代表。我们强调，此阈值不用于分类杂交状态或识别遗传上"纯种"的狼。相反，它仅用于识别具有相对同质种群血统的个体，以便基于模拟校准种群特异性杂交阈值，并减少后续杂交分析中狼群间混合的影响。

q < 0.8的个体被视为显示混合分配，这可能反映狼群间混合、狼-犬杂交，或两者兼有。区分这些可能性并非此分析的目标，仅在后续杂交分析中处理。重要的是，这些个体未被从后续分析中排除，而是在每个推断的狼种群集群内独立分析。q = 0.8作为种群结构步骤中预定义集群成员资格的实用截断值，与基于STRUCTURE的分配分析中的常见做法一致，其中低于此阈值的个体通常被解释为混血。

**STRUCTURE和NewHybrids阈值的确定**

为了区分杂交个体与纯种狼，我们首先使用HYBRIDLAB 1.1生成的模拟基因型定义了分类混血个体的分配阈值。HYBRIDLAB使用经验定义的亲本种群的等位基因频率生成代表纯种和杂交类别的多位点基因型，从而评估不同杂交类别的预期遗传分布。由于在狼数据集中检测到种群结构，模拟对每个种群集群分别进行。对于每个种群集群，选择具有代表性的犬面板（N = 67）和狼面板（N = 67），仅使用分类为非混血的个体，并保持推荐的最佳等样本量。在小型且地理受限的种群集群中，狼的选择完全随机化。覆盖更广阔地理区域的大型种群集群被划分为区域，并确保从每个区域选取的个体数量反映该区域在种群集群中的比例代表性。对于每个种群集群，我们对两个亲本种群（狼和犬）及每个杂交类别模拟100个基因型：第一代杂交（F1）、第二代杂交（F2）、第一代回交至狼（BC1W）和第一代回交至犬（BC1D）。这些模拟数据集随后用于基于纯种与杂交类别间预期遗传重叠来定义分配阈值。

每个种群集群的模拟数据集随后使用STRUCTURE和NewHybrids进行分析。在STRUCTURE中保留等位基因频率相关模型，因为狼和家犬代表近期分化且历史上相互关联的基因库，具有大量共享遗传变异。该模型已被证明能改善亲缘关系密切群体间细微种群结构和混合的推断，并常规应用于狼-犬杂交和渗入的研究。为定义保守的杂交检测阈值，我们专注于最小化II类错误（将杂交个体误分类为纯种狼）。由于第一代回交至狼（BC1W）代表遗传上与纯种狼最相似、因此最难检测的杂交类别，阈值从该类别推导。具体而言，对于STRUCTURE，模拟BC1W个体中观察到的向狼集群分配概率（qw）的最大值被用作阈值。对于NewHybrids，模拟BC1W个体中分配至纯种狼类别的后验概率（pw）的最大值被选为阈值。推导的阈值随后应用于经验数据集以识别与纯种狼血统一致的个体，并标记具有潜在杂交来源的个体。此外，每个种群集群的模拟个体还使用PCA图进行可视化。

**STRUCTURE和NewHybrids阈值在经验数据中的应用**

随后对定义的每个经验种群集群与比较犬（N = 67）结合使用上述设置进行STRUCTURE和NewHybrids分析。在STRUCTURE分析中qw超过集群特异性阈值，且NewHybrids分析中pw同时超过集群特异性阈值的个体被分类为纯种狼。

由于混合群体祖先的个体被纳入了所有群体聚类的分析，因此如果他们在至少一个群体聚类中的 qw 和 pw 值高于 STRUCTURE 和 NewHybrids 设定的各自阈值，则将其视为纯种狼。每个群体聚类的数据连同比较犬一并进行主成分分析（PCA）可视化展示。

阈值以下个体的验证

未能通过 STRUCTURE 或 NewHybrids 设定的阈值而被认定为纯种狼的个体，接受了额外的分析以确认其身份，使用了线粒体 D-loop 和常染色体 SNP 标记。对于 D-loop 分析，所得序列在 Geneious Prime 中进行了编辑，修剪至 230 个碱基对，并使用 Geneious 比对算法与 Pilot 等人提供的参考序列进行比对。单倍型根据 Pilot 等人使用的编码方式进行了确定和标记。

SNP 等位基因使用 Standard BioTools SNP 基因分型分析软件 1.0.2 进行评分。受测个体与不同品种的比较犬（N = 15）以及在不同群体聚类间具有不同程度混合的比较纯种狼（N = 52）一起进行分析。它们使用 STRUCTURE 的混合模型和关联等位基因频率模型以及 NewHybrids 进行了分析，数据还通过 PCA 图进行了可视化展示。

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文件 S1. 表 S1 和 S2

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数据 S1. STR 和 SNP 数据集