有机叶片基质、初始pH与振荡对枯草芽孢杆菌PY79脲解型碳酸钙沉淀的协同调控

《Life》：Effects of Leaf Substrate, pH and Agitation on Ureolytic Calcium Carbonate Precipitation by Bacillus subtilis

　　

近年来，微生物碳酸钙沉淀（microbial carbonate precipitation，MCP）在结核形成和化石保存中的作用已被提出。本研究考察了以银杏（Ginkgo biloba）和Davallia fejeensis叶片形式存在的有机物，在不同pH和振荡条件下对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PY79菌株所致MCP的影响。本研究结果表明，有机基质的存在在振荡条件下导致更高的方解石沉淀。在初始pH为中性的处理中观察到最高的尿素水解和Ca²⁺消耗。叶片的表面性质和生化差异可能通过影响细菌生长以及与B. subtilis PY79碳酸盐生物矿化相关的条件，影响碳酸钙沉淀效率。研究人员的结果表明，有机基质的存在增加MCP。未来研究将聚焦自然环境中的微生物席在碳酸盐沉淀和叶片矿化中的作用。

研究背景方面，地质记录中已描述特异保存、正常保存和选择性保存等化石保存模式；特异保存可在由方解石、菱铁矿、磷灰石或白云石等矿物组成的结核中保留软组织或整个生物体。叶片化石是化石记录中常见的植物残体，并常保存于结核内；特异保存的植物化石可提供原始生化组成、沉积环境和早期成岩过程信息。由于结核常在腐烂有机质周围快速形成，理解结核形成过程对解释特异保存至关重要。越来越多证据表明，微生物活动可贡献于软组织保存和腐烂有机质周围结核形成。MCP是生物矿化的一种形式，指微生物活动与周围环境有机或无机组分相互作用导致碳酸钙（CaCO₃）沉淀；其见于洞穴、土壤、淡水系统、海洋沉积物和高盐环境，也参与叠层石和凝块石等微生物岩形成，并在环境修复、重金属固定、自修复生物混凝土和碳封存等方面受到关注。MCP常与生物膜形成和局部地球化学条件变化相关；微生物产生胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS），形成生物膜，促进矿物成核和沉淀。微生物可通过带负电官能团结合Ca²⁺、通过脲解（ureolysis）等代谢提高碱度、并以细胞或有机基质作为成核表面促进碳酸盐形成。脲解因高效促进CaCO₃沉淀而被广泛研究；脲酶水解尿素产生铵和碳酸氢根，提高碱度，使碳酸根与Ca²⁺反应并在细菌细胞、EPS或其他表面沉淀。Bacillus属中B. cohnii、B. pseudofirmus、B. subtilis和B. alkalinitrilicus等可脲解并通过脲酶活性促进碳酸盐沉淀，但CaCO₃产量、形态和矿物多型随菌株和环境条件变化。温度、pH、振荡、营养可用性、胶结试剂、盐度和有机物组成等可影响微生物活动、生物膜发育及碳酸盐矿物大小和丰度。既往研究考察了细菌细胞浓度、胶结试剂、氧可用性、pH和营养需求对MCP的影响；相较之下，自然有机基质特别是叶片对脲解活性和碳酸盐沉淀的影响关注较少。尽管微生物参与化石保存的证据增加，但微生物碳酸盐沉淀与结核形成之间的联系仍不清楚。因此，本研究考察B. subtilis PY79在陆生叶片存在下的脲解型MCP，并考察pH和振荡影响，通过比较不同叶片基质在受控条件下评估微生物活动、富含EPS的生物膜、环境条件和有机表面如何相互作用调控碳酸盐沉淀，以期为碳酸盐结核形成和化石保存提供启示。

方法上，研究人员以银杏（Ginkgo biloba）和Davallia fejeensis叶片圆片为有机基质，银杏叶采自Curtin University校区两棵树，Davallia叶来自Perth当地苗圃；B. subtilis PY79来自Curtin University实验室库存。将叶片置于含尿素和氯化钙的碳酸钙形成培养基（CCFM）中，设置振荡/静置、初始pH 3、5、7、9、有叶/无叶及生物/非生物对照，28 °C培养5天。通过二甲基氨基苯甲醛（DMAB）法监测残余尿素、络合滴定测定可溶性Ca²⁺，用扫描电子显微镜-能谱（SEM-EDS）观察生物膜和矿物元素组成，用X射线粉末衍射（XRD）分析矿物相，并以双因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和t检验进行统计比较。

研究结果如下。3.1 振荡对B. subtilis PY79所致MCP的影响。3.1.1 脲解活性测定：通过监测尿素浓度下降发现，振荡和静置条件下有叶处理的尿素水解均快于无叶对照；振荡下蕨叶和银杏叶前24 h分别水解约96 mM和29 mM尿素，银杏处理第3天完全水解；静置下分别约86 mM和17 mM，蕨叶第4天、银杏第5天完全水解；无叶对照仍约3 mM尿素。总体振荡快于静置，蕨叶快于银杏和无叶处理；非生物对照无可测尿素下降。3.1.2 可溶性Ca²⁺估算：通过滴定监测可溶性Ca²⁺发现，振荡下蕨叶和银杏叶前24 h分别由50 mM降至约13 mM和33 mM，蕨叶第3天、银杏第4天完全耗竭；无叶对照5天后约剩1.5 mM。静置下前24 h分别降至约36 mM和44 mM，两种叶片第5天完全耗竭，无叶对照约剩3 mM。总体振荡下Ca²⁺下降更快，蕨叶最快，其次银杏和无叶对照；非生物对照无检测性下降。3.1.3 形貌与矿物学研究：SEM显示振荡5天后两种叶片均广泛覆盖生物膜基质和大量矿物；蕨叶矿物主要呈球形、约10 μm并有一些不规则形态，银杏叶矿物较大、约20 μm且主要不规则，无叶对照矿物较少但较大、约40–50 μm且主要球形；静置下两种叶片矿物更少更小（<5 μm），表面仅部分覆盖生物膜；EDS检测到C、Ca和O，与CaCO₃元素组成一致，矿物表面见细菌细胞形印痕；非生物对照无生物膜发育和CaCO₃沉淀。3.2 不同pH的影响。3.2.1 脲解活性测定：通过监测尿素浓度发现，除pH 3外各pH有叶处理均发生快速脲解；pH 7下降最大，前24 h蕨叶和银杏叶分别水解约91 mM和56 mM尿素，银杏第4天完全水解；pH 9较慢，蕨叶第4天、银杏第5天完全水解，无叶对照5天后约剩35 mM尿素；pH 5进一步降低，两种叶片5天后均剩>25 mM尿素；pH 3无尿素下降。总体pH 7最高，蕨叶高于银杏和无叶处理；非生物对照无尿素水解。3.2.2 可溶性Ca²⁺估算：通过滴定发现，有叶处理Ca²⁺下降快于无叶对照，pH 7最快；pH 7前24 h蕨叶和银杏叶分别降至约20 mM和23 mM，蕨叶第3天、银杏第4天不可检测；pH 9前24 h分别约33 mM和46 mM；pH 5较慢，结束时蕨叶和银杏叶分别约剩8 mM和6 mM；pH 3无实质变化。总体pH 7 Ca²⁺去除最快，蕨叶一般高于银杏；各pH下有叶系统均比无叶对照更明显；非生物对照无Ca²⁺去除。3.2.3 形貌与矿物学分析：SEM显示pH 5、7、9下两种叶片均有生物膜形成和矿物沉淀，pH 3无生物膜和矿物；pH 7生物膜覆盖和碳酸盐沉淀最广泛，5天后两种叶片广泛覆盖生物膜-EPS基质和大量矿物，矿物主要球形、常为融合聚集体、约100 μm；无叶对照也有碳酸盐矿物但较少、较大且主要球形；pH 9两种叶片覆盖致密生物膜但矿物较少、约10 μm、主要球形并有一些不规则形态；pH 5生物膜明显但矿物少于pH 7，蕨叶矿物主要球形约50 μm，银杏叶较小约30–50 μm且主要不规则；EDS检测到C、Ca和O，与CaCO₃形成一致，矿物表面见细菌细胞形印痕；非生物对照无生物膜和碳酸盐沉淀。3.3 XRD物相分析：对蕨叶振荡培养后CCFM中剩余矿物进行XRD，主相为方解石型矿物，包括含镁方解石（Mg-bearing calcite）；还检测到少量含磷酸盐相鸟粪石（struvite，NH₄MgPO₄·6H₂O，约6.1%）；SEM-EDS未识别鸟粪石，但XRD检测到其存在。

讨论部分总结认为，有机质可在结核形成中提供微生物定殖基质和矿物成核表面或模板，但有机基质对微生物介导碳酸盐沉淀的影响在受控条件下仍不清楚。本研究中叶片材料并非碳酸盐沉淀所必需，但其存在和类型影响过程速率和程度，支持有机基质在碳酸盐结核形成和化石保存早期矿化中的潜在作用。叶片处理中尿素水解更快，尤其蕨叶，可溶性Ca²⁺下降也更快；无叶处理虽也发生明显Ca²⁺耗竭，但有叶处理更早完全耗竭。SEM显示叶面广泛生物膜和丰富碳酸盐沉淀，提示有机质不仅是被动沉积表面，还可影响微生物活动和碳酸盐沉淀空间分布。一种可能解释是Ca²⁺与叶面微生物细胞和EPS相互作用；细菌细胞表面和EPS含羧基（-COO^–）和磷酸基（PO₄^3–）等带负电官能团，可结合Ca²⁺等二价阳离子，生物膜可能在局部微环境浓集Ca²⁺并提供成核和生长有利条件；但本研究未直接测定Ca²⁺与EPS或叶面结合，因此该机制仍为合理解释。无叶对照也发生碳酸盐矿化，说明叶片材料非B. subtilis PY79脲解型碳酸盐沉淀所必需；脲解本身可产生有利条件，细菌细胞表面和胞外物质可提供成核位点，但叶片存在时沉淀更快更广泛，表明叶面增强而非启动该过程。第5天叶面见广泛富含EPS生物膜覆盖；叶片物理结构可能提供额外细菌附着和滞留表面，促进生物膜和EPS局部积累，EPS提供成核位点，带负电微生物表面结合Ca²⁺等，可能贡献于有叶处理相对无叶对照的增强沉淀。蕨叶和银杏叶响应不同，提示有机基质性质影响MCP；蕨叶持续支持更快尿素水解和Ca²⁺耗竭，尤其早期，且两种叶片上碳酸盐矿物丰度、大小和形态不同。这些差异可能反映叶面性质和生化组成差异；蕨叶含特有细胞壁多糖，Davallia物种研究报道多种糖基化酚类化合物和其他次生代谢物；某些植物多糖可作为环境信号刺激生物膜发育并提供胞外基质形成所需碳水化合物底物，这可能解释蕨叶处理更强脲解响应和更快Ca²⁺耗竭，但由于未比较量化多糖浓度和生物膜丰度，该关系仍为合理解释而非直接证明原因。相反，银杏叶含银杏酸等具报道抗菌活性的化合物，也可能影响细菌活动和后续碳酸盐沉淀。环境条件也强烈影响有机质与脲解型MCP的相互作用；pH 7脲解活性最高、Ca²⁺耗竭最快，pH 9也有明显活性，pH 5降低，pH 3未检测到。这与中性至适度碱性条件有利于Bacillus相关系统脲解活性和碳酸盐沉淀的既往研究一致，Bacillus spp. EPS产生也据报道在中性pH附近更有利；pH 7启动处理中增强的MCP可能反映B. subtilis整体生理、脲酶功能、生物膜发育和碳酸盐过饱和的有利条件。振荡模拟波浪作用，连续混合增加细菌细胞、尿素、Ca²⁺和其他溶解组分接触，改善传质，促进尿素水解和后续CaCO₃沉淀；混合还可维持更均匀物理化学条件并增强气体交换，影响碳酸盐饱和和沉淀；增加气体交换和脱气可影响碳酸盐平衡并促进CaCO₃过饱和；振荡还增加反应物接触并可能改善氧传递和可用性，对B. subtilis好氧呼吸重要；但40 rpm并非直接再现自然波浪作用，结果说明增加混合和曝气可改变微生物活动、有机表面和碳酸盐沉淀相互作用。SEM显示有机基质类型和周围物理化学条件影响碳酸盐矿物形态；振荡下蕨叶相关矿物主要小而球形，银杏叶上形成较大且更不规则矿物；静置下两种叶片矿物更小更少；矿物形态也随pH变化，pH 7形成大且常融合矿物，pH 9形成较小矿物；生物成因CaCO₃大小和形态变化可能反映沉淀速率、局部地球化学、微生物活动和矿物生长条件差异。XRD确认方解石和含镁方解石为实验产生的主要矿物相，与既往脲解型碳酸盐沉淀研究一致；还检测到少量鸟粪石，当铵、Mg²⁺和磷酸盐同时可用时有利于鸟粪石形成；本实验中尿素水解产生铵，在培养基Mg²⁺和磷酸根存在下可能促进鸟粪石沉淀；鸟粪石虽非常见化石矿物相，但实验鱼类埋藏学研究记录其在腐烂早期形成并提出其可能代表与软组织后续磷酸化相关的早期矿物相；本研究中鸟粪石出现因此与埋藏学背景相关，表明有机质相关脲解型微生物活动可产生有利于碳酸盐和含磷酸盐矿物形成的地球化学条件；当矿物沉淀快速广泛时，这些自生矿物可包覆或包裹生物组织，限制物理和化学降解，从而提高保存可能性。研究结果支持有机质存在、组成和物理性质可影响早期微生物介导矿化的长期观点，进而可能影响早期成岩中组织优先保存或降解及其化石化可能性；叶面支持生物膜发育和局部碳酸盐沉淀，程度随叶片类型和环境条件变化；既往研究也显示有机基质可增强微生物诱导碳酸盐沉淀；自然埋藏环境中腐烂有机质、微生物生物膜和成矿离子之间这类相互作用可能贡献于生物表面稳定或矿物包覆，并可能是碳酸盐结核早期发育的若干过程之一。局限包括实验系统仅为自然化石化简化组分；pH和细菌丰度仅在实验开始时控制而未在培养期间监测，因此尿素水解差异不能完全归因于特定脲酶活性变化，pH和细菌生长的时间变化也可能贡献观察响应；SEM-EDS仅分析外叶面相关矿化，未分别分析上下叶面，也未检查内部组织胞内矿化；自然环境含多样微生物群落和多种相互作用代谢途径，包括硫酸盐还原、光合作用、产甲烷、氨化、发酵等，均可改变局部地球化学条件并影响矿物沉淀；化石化发生在更长时间尺度，涉及有机质逐渐降解、沉积物相互作用、氧化还原条件变化和孔隙水化学变化；脲解应视为贡献有机质早期矿化的一个潜在机制，而非结核形成或化石保存的完整模型。尽管如此，本研究提供受控框架考察有机质如何影响脲解型碳酸盐沉淀；结果显示叶片基质可改变微生物活动、生物膜发育、Ca²⁺利用和矿物形成，且这些相互作用强烈受pH和振荡影响；未来结合自然微生物群落、沉积物和更长培养期的研究可在此基础上确定多种代谢途径如何与不同形式有机质相互作用并影响植物材料矿化和保存。

研究结论（翻译）：本研究表明，有机叶片基质影响B. subtilis PY79的脲解型碳酸盐沉淀，且该响应随叶片类型和环境条件而变化。叶片存在与更快的尿素水解和Ca²⁺耗竭、广泛生物膜发育和丰富CaCO₃沉淀相关，蕨叶通常比银杏叶产生更强响应；这些差异提示有机基质的物理和化学性质可影响微生物活动模式和早期矿化。MCP在pH 7和振荡条件下最显著，进一步突出物理化学条件在调控脲解活性和矿物形成中的重要性。方解石和含镁方解石是丰富矿物相，同时检测到少量鸟粪石；鸟粪石的出现与实验埋藏学尤其相关，因为该矿物曾在腐烂早期阶段被报道并与软组织后续磷酸化相关。这些发现表明，脲解型微生物活动可在有机基质存在下创造有利于碳酸盐和含磷酸盐矿物沉淀的条件。总体而言，结果为微生物、有机质和环境条件之间的相互作用可影响早期矿化过程提供了实验证据；尤其是有机基质组成和物理特征的差异可能影响微生物介导的矿物沉淀，并可能影响早期成岩过程中降解与保存之间的平衡。尽管该单培养系统仅代表自然化石化复杂过程的一个组分，但它为可能参与碳酸盐结核形成早期和有机残体保存的机制提供了见解。