《iScience》：Comprehensive approach to characterize the circuit between the E and the MVL concerned with visual processing in the avian pallium
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与大多数哺乳动物一样，鸟类拥有先进的视觉感知能力。然而，禽类端脑（avian pallium）的组织结构与哺乳动物层状皮层（layered cortex）存在显著差异。本研究采用病毒示踪技术，揭示了鸽（Columba livia）端脑中两个视觉处理区域——内端
与大多数哺乳动物一样，鸟类拥有先进的视觉感知能力。然而，禽类端脑（avian pallium）的组织结构与哺乳动物层状皮层（layered cortex）存在显著差异。本研究采用病毒示踪技术，揭示了鸽（Columba livia）端脑中两个视觉处理区域——内端脑（entopallium, E）与腹外侧中端脑（mesopallium ventrolaterale, MVL）之间的神经连接呈双向性，但以E→MVL方向为主导。投射至E或接受E投射的MVL神经元均呈SATB2免疫阳性。基于单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，NeuronChat分析表明E→MVL方向的配体-受体（ligand-receptor, LR）相互作用强度显著高于MVL→E方向。电生理学研究表明，MVL神经元表现出更延长的感受野（receptive field, RF）。对接受E投射的MVL中SATB2阳性细胞进行三维重建，结果显示近端树突区室中富集成熟蘑菇型树突棘（mushroom spine）。上述结果有助于深化对禽类端脑视觉处理神经机制的理解。
一、研究背景与科学问题
在哺乳动物中，多层神经环路是感觉处理和高阶知觉的基础。鸟类的 tectofugal 通路（中脑-丘脑-端脑视觉通路）是一个高度分层的视觉系统，其中丘脑圆核（nucleus rotundus, Rt）投射至内端脑（entopallium, E），E进一步投射至腹外侧中端脑（mesopallium ventrolaterale, MVL）、nidopallium 和 arcopallium 等区域。在 tectofugal 通路中，E主要处理颜色、朝向和亮度等基本视觉特征，在功能上被认为与哺乳动物的纹外皮层（extrastriate cortex）相当；而MVL参与更高级的计算，包括不变物体识别和复杂类别学习。
在羊膜动物进化过程中，以核团组织为特征的禽类端脑与哺乳动物新皮层相比经历了显著的形态学变化。比较发育和转录组学研究表明，尽管大多数抑制性神经元类型在羊膜动物中进化保守，但谷氨酸能端脑神经元已经发生分化。SATB2是一种同源域转录因子，在哺乳动物胚胎皮层中表达于浅层，通过抑制Ctip2转录来调控胼胝体/皮层-皮层投射神经元的身份。在鸟类中，mesopallium（包括MVL）是SATB2特别富集的区域，但这些SATB2阳性神经元如何整合到E-MVL环路中进行视觉处理尚不清楚。
针对上述问题，研究人员采用综合方法研究E?MVL环路：首先应用病毒示踪绘制环路拓扑结构；结合免疫细胞化学染色和已发表的鸡脑单细胞RNA测序数据，确定E-MVL环路中的SATB2神经元和基因表达；利用NeuronChat预测MVL和E神经元间的配体-受体（ligand-receptor, LR）互作模式；比较E和MVL视觉诱发感受野（receptive field, RF）的变化；最后研究接受E投射的MVL SATB2阳性神经元的树突棘特征。
二、主要研究结果
1. E?MVL环路中神经连接的显著偏置
研究人员将顺行示踪剂HSV-H129-4G（单纯疱疹病毒，滴度2.00×109 PFU/mL）单侧注射至E或MVL。在注射后56小时，HSV标记在投射区域清晰可见。HSV注射至MVL后，E中标记细胞稀疏分布；而HSV注射至E后，MVL内出现密集标记，表明E与MVL之间的神经连接存在显著偏置。此外，将顺行HSV和逆行CTB-555（霍乱毒素B亚单位）注射至E同一部位后，MVL中观察到双标记神经元，表明同一MVL神经元既接受E的传入支配，又向E发送输出反馈，形成紧密的E?MVL环路。
2. E和MVL中SATB1/2免疫细胞化学及基因表达
免疫细胞化学染色表明，部分逆行或顺行标记的MVL神经元（分别通过CTB或HSV-H129-4G注射至E）呈SATB1/2阳性。参考Zaremba等人的鸡脑单细胞转录组结果，在对应于MVL的区域中，兴奋性神经元大多数为仅SATB2阳性或SATB1和SATB2双阳性，仅少量细胞单独表达SATB1。转录组分析显示，E显著富集兴奋性亚型Ex_DACH2_ADAMTS5和Ex_DACH2_ZMAT4，而MVL高度富集Ex_SATB2_ZNF385B和Ex_KIAA1217兴奋性亚型。
3. NeuronChat分析揭示E?MVL环路中的配体-受体互作
NeuronChat预测在MVL内部富集配体-受体互作，特别是涉及黏附相关配对如Nrxn3–Nlgn1和Nrxn1–Nlgn1。方向性推断显示E→MVL互作强度超过MVL→E达2.12倍，与病毒示踪观察到的解剖学偏置一致。E中的Ex_DACH2神经元被预测与MVL神经元具有优先的配体-受体互作潜力，特别是通过Nrxn3–Nlgn1和Nrxn1–Nlgn1黏附配对。预测的E→MVL互作还包括气体和肽能信号，如NO-Gucy1a1和Adcyap1-Vipr1配对；而推断的MVL→E互作相对稀疏，以Nts-Ntsr1为主。
4. E和MVL之间感受野几何特性的差异
尽管E和MVL的RF面积无显著差异，但MVL-RF表现出显著更高的长宽比（2.31 vs. 1.90），形成更延长的椭圆形MVL-RF。E和MVL均表现出RF朝向向N-NE方向（0°–48°）的强烈集中，但MVL-RF的朝向轴角离散度显著降低，圆标准差更低（4.24° vs. 14.16°），表明MVL对N-NE方向的朝向偏好更集中。
5. MVL中SATB2阳性投射神经元的三维重建揭示树突棘特征
对接受E投射的MVL SATB2阳性神经元进行三维重建，平均总树突长度为524.4 ± 133.4 μm，棘密度为每10 μm 6.27 ± 0.71。Sholl分析显示树突延伸至距胞体106.4 ± 12.1 μm，分支复杂度峰值位于30.7 ± 4.1 μm。沿近端-远端轴分析发现，蘑菇型树突棘在近端区室中优先富集，而细长型树突棘在远端区室中逐渐积累（蘑菇型：近端9.5%降至远端4.0%；细长型：近端41.3%升至远端86.7%）。
三、主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：病毒示踪技术（HSV-H129-4G顺行跨突触示踪和CTB-555逆行示踪）用于绘制E-MVL环路连接；免疫细胞化学染色（anti-Satb1/2抗体）用于鉴定SATB2阳性神经元；基于公开的成年鸡端脑单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据集（Zaremba et al.，
https://doi.org/10.11588/data/BX6REK ）进行转录组分析，结合Baysor细胞分割和Tangram空间映射将单细胞数据映射至空间转录组数据；NeuronChat v1.0.0（小鼠配体-受体数据库，经严格直系同源过滤）用于预测细胞间通讯；在体电生理记录（16通道硅探针，Apollo采集系统，30 kHz采样率）结合视觉刺激用于感受野分析；Neurolucida 360用于神经元和树突棘的三维重建。实验动物为40只成年雌雄鸽（Columba livia，350–450 g），购自河北明学鸽场。
四、讨论与结论
本研究从神经连接、神经元类型、配体-受体互作、感受野几何特性和树突棘特征五个层面表征了禽类tectofugal通路中的E-MVL环路。在神经连接层面，时间分辨病毒示踪揭示了E?MVL环路的显著不对称性：E→MVL投射数量占优，而MVL→E投射相对稀疏，呈现数量占优的前馈和低密度反馈模式。免疫细胞化学研究表明，部分从E逆行投射的神经元和向E顺行投射的神经元均为SATB2阳性，为视觉处理提供了结构基础：来自E的广泛分布式输入可汇聚至MVL，而稀疏的MVL→E投射可能对E产生更具选择性的影响。
NeuronChat分析预测的E→MVL配体-受体互作偏置与病毒示踪观察到的解剖学偏置一致。neurexin-neuroligin信号在皮层环路突触组织和成熟中的既定作用提示，跨突触黏附可能有助于E来源输入在MVL上的特异性和稳定性；一氧化氮-cGMP信号与活动依赖性突触调节相关，预测的神经调节互作可能影响MVL神经元中E来源输入的增益和整合。
电生理学研究表明，MVL神经元表现出显著更高的RF长宽比、显著降低的RF朝向轴离散度，以及更强延长的群体对齐各向异性RF结构，这些特征被认为通过减少RF朝向变异性来有效耦合空间频率和朝向处理。
树突棘分析显示，接受E投射的MVL SATB2阳性神经元沿树突存在空间分离的棘类型分布：近端区室显著富集蘑菇型棘，远端区室积累细长型棘。蘑菇型棘可能参与处理相对稳定的局部加权输入，而可塑性的细长型棘有助于突触输入的局部功能聚类和树突非线性整合。
研究局限性包括：免疫组化信号主要来源于SATB2的推断无法完全排除非特异性抗体结合的可能性；NeuronChat配体-受体数据库基于小鼠和人类数据开发，跨物种应用存在固有限制；谷氨酸能端脑神经元（包括SATB2表达群体）在鸟类和哺乳动物之间并非强保守，应谨慎对待与哺乳动物SATB2相关环路功能的直接比较；50 μm脑片的三维重建可能导致树突截断，低估总树突长度和分支复杂度。
结论：本研究综合运用病毒示踪、免疫细胞化学、单细胞转录组学、NeuronChat通讯推断、电生理记录和三维形态重建，系统表征了禽类端脑E-MVL视觉处理环路。研究揭示了E→MVL占优的双向连接模式、SATB2兴奋性神经元在环路中的分布、E→MVL配体-受体互作强度的优势、MVL神经元更延长的感受野特征，以及近端树突区室蘑菇型棘的富集，为深入理解禽类端脑视觉处理的神经机制提供了多维度证据。
