肿瘤组织miR-143和miR-29b表达作为接受辅助化疗的胰腺导管腺癌切除患者预后生物标志物

《Diagnostics》：Tissue miR-143 and miR-29b Expression as Prognostic Biomarkers in Patients with Resected Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Receiving Adjuvant Chemotherapy

　　

背景/目的：胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是预后最差的实体瘤之一，对于接受切除术序贯辅助化疗（adjuvant chemotherapy）的患者，仍缺乏可补充标准病理变量的生物标志物。研究人员检测10种选定微小RNA（microRNAs, miRNAs）的肿瘤表达是否与该临床情境下的复发模式和生存相关。方法：回顾性研究单中心2012—2022年接受辅助化疗的50例切除PDAC患者。采用定量实时PCR（quantitative real-time PCR）检测福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）肿瘤组织中let-7c、miR-10b、miR-27a、miR-29b、miR-31、miR-34a、miR-142、miR-143、miR-17-5p和miR-200c的表达，其中21例有癌旁非肿瘤胰腺组织。以miRNA表达中位数二分类，采用logistic回归（logistic regression）和Cox回归（Cox regression）评估其与局部复发、转移、无病生存（disease-free survival, DFS）和总生存（overall survival, OS）的关联。结果：7种miRNA（let-7c、miR-27a、miR-29b、miR-31、miR-34a、miR-143、miR-200c）在肿瘤组织中下调，miR-10b上调（均p < 0.05）。肿瘤miR-143较高表达与局部复发相关，miR-29b较高表达与较短DFS相关。腺鳞癌组织学与较短DFS和OS独立相关。结论：肿瘤miR-143较高表达与局部复发相关，miR-29b较高表达与较短DFS相关。这些探索性关联需在更大型独立队列中验证。

研究背景：胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）为预后最差的实体瘤之一，尽管外科技术和系统治疗已有进展，5年生存率仍约2–9%。手术切除后辅助化疗是唯一具有治愈意图的治疗，但多数患者2年内复发，且多数死于复发。对于切除并接受化疗的人群，临床缺乏可用于预判复发模式及生存时间的分子工具。切缘状态、淋巴结受累、神经周围侵犯和组织学亚型等标准病理变量仅解释部分预后异质性，经验证、可补充这些特征并细化术后风险分层的生物标志物仍是未满足需求。微小RNA（microRNA, miRNA）为约22个核苷酸的小非编码RNA，通过结合靶信使RNA的3′非翻译区促进降解或翻译抑制，在FFPE组织中稳定、可用RT-qPCR重复定量；在PDAC中，不同miRNA特征可区分肿瘤、慢性胰腺炎和正常胰腺，部分miRNA参与侵袭、上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）和化疗耐药。既往PDAC miRNA研究多基于可切除、局部晚期和转移性疾病混合队列，在切除术后接受辅助化疗这一特定人群中，miRNA预后价值研究较少。因此，研究人员假设一组明确的肿瘤组织miRNA丰度与局部复发、远处转移、无病生存（DFS）和总生存（OS）相关；所选miRNA覆盖EMT、干性/增殖调控、间质与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）生物学、侵袭及免疫/炎症调控等程序。研究目的是在单中心切除PDAC并接受辅助化疗队列中，检测10种miRNA在肿瘤组织相对癌旁非肿瘤组织的表达是否与复发模式和生存相关。

关键技术方法：研究为单中心回顾性队列，来源为Bursa Uluda? University医学系肿瘤内科2012年1月至2022年12月接受辅助化疗的切除PDAC患者50例，其中21例有癌旁非肿瘤胰腺组织。采用FFPE肿瘤组织行RT-qPCR检测10种miRNA，以U6 small nuclear RNA（U6 snRNA）和SNORD48为内参，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达，统计时使用ΔCt并以中位数二分类；以logistic回归分析局部复发，以Cox回归分析DFS和OS。

研究结果：3.1 患者特征：共纳入50例切除PDAC并接受辅助化疗患者，诊断时平均年龄61.6 ± 11.2岁，男性34例（68%）；21例有配对癌旁非肿瘤胰腺组织。中位DFS为8个月（95% CI 5.4–10.6），中位OS为16个月（95% CI 11.4–20.6）。该部分通过临床资料描述和随访生存统计得出。3.2 肿瘤与癌旁非肿瘤组织miRNA表达：在21对样本中，10种miRNA中有7种在肿瘤与癌旁组织间差异表达；let-7c、miR-27a、miR-29b、miR-31、miR-34a、miR-143和miR-200c在肿瘤组织中显著下调，miR-10b上调（均p < 0.05）；miR-142和miR-17-5p无显著差异。该结论通过配对组织比较得出。3.3 与局部复发的关联：对全部50例以miRNA表达中位数二分类分析，局部复发组仅miR-143显著较高；神经周围侵犯也可区分两组。多变量二分类logistic回归纳入单变量p < 0.05变量后，高miR-143表达与局部复发风险约增加4倍相关（OR 4.14，95% CI 1.09–15.67，p = 0.036），神经周围侵犯为第二个独立变量（p = 0.025）。该结论通过局部复发有无比较及多变量logistic回归得出。3.4 与远处转移的关联：任何解剖部位远处转移者与无转移者之间，无miRNA表达差异达显著，也无临床病理变量达统计显著；转移组miR-10b较高、miR-200c较低的趋势未达预设阈值，原文未进一步讨论。该结论通过远处转移有无比较得出。3.5 无病生存和总生存：单变量Kaplan–Meier分析显示，腺鳞癌组织学与较短DFS和较短OS相关；高miR-29b表达与较短DFS相关；高miR-142表达与较短OS相关。多变量Cox回归中，腺鳞癌组织学与DFS独立相关（HR 4.11，95% CI 1.61–10.76，p = 0.003），高miR-29b表达与DFS独立相关（HR 1.99，95% CI 1.08–3.66，p = 0.027）。对于OS，仅腺鳞癌组织学保留独立预后价值（HR 5.10，95% CI 1.82–14.30）；miR-142在校正后未保持显著。主要预后发现为：10种miRNA中，仅高miR-143表达独立与局部复发相关，仅高miR-29b表达独立与较短DFS相关。该结论通过生存分析和多变量Cox回归得出。

讨论与结论总结：讨论提出三项主要发现：第一，肿瘤组织中7/10 miRNA下调、1种上调，与7种下调miRNA以抑癌功能为主及miR-10b既往被归因于促癌和转移功能的模式一致。第二，miR-143残余表达与局部复发独立相关，miR-29b残余表达与DFS独立相关。第三，腺鳞癌组织学是唯一同时独立与DFS和OS相关的变量。原文强调miR-143和miR-29b在肿瘤相对癌旁的比较中表现为抑癌样改变，但在肿瘤内部又可识别预后较差患者，这一表面矛盾源于两类分析问题不同：配对比较反映肿瘤转化伴随的平均miRNA丢失，预后分析则比较肿瘤间残余变异是否携带临床信息；转化中绝对下降的miRNA，若其残余丰度反映驱动复发相关生物学程序的活性，仍可提供预后分层。原文提出，miR-143和miR-29b在正常间质细胞高表达，作用于胶原沉积、成纤维细胞活化和基质硬度相关靶点；Kwon等提示miR-29家族在胰腺间质丰富，调节癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）与肿瘤细胞交互，并影响肿瘤生长和化疗耐药。FFPE bulk肿瘤组织信号混合上皮和间质贡献，残余信号较高可能提示间质增生或活性较强；PDAC纤维增生与间质液体压力升高、药物递送受损及术后残留病生存微环境相关。但原文指出，本研究未进行区室特异评估，无法确定预后关联来自肿瘤上皮细胞、间质细胞或两者。miR-143的间质表达参与成纤维细胞活化和基质重塑，与局部侵袭及切除床微小残留病生态位相关。原文还提出EMT相关通路可能是解释之一，但本研究未评估EMT标志物或信号通路，因此该解释属推测；miR-143和miR-29家族可调节EMT相关程序，包括钙黏蛋白转换、波形蛋白表达及SNAI1、ZEB1等转录因子活性；EMT是PDAC细胞耐受细胞毒应激并播种局部复发的途径之一，EMT调节因子与临床结局关系呈非单调性，过高或不足活性均可产生促进播散的表型；高残余miR-143与局部复发、高残余miR-29b与较短DFS的关联符合该非单调模式。文献中miR-29b预后方向依赖组织区室、疾病亚型和治疗背景：一些系列报告低miR-29b与较短生存相关，包括乳腺癌和胶质母细胞瘤；另一些尤其研究PDAC间质miR-29家族的研究发现较高水平伴随侵袭性疾病。原文认为，在本队列所有患者均接受切除后辅助化疗的背景下，miR-29b预后信号可能更多反映残留肿瘤床间质活性，而非肿瘤细胞自主抑癌功能；miR-143在非小细胞肺癌中曾被描述为抑癌因子，但其在PDAC间质和切除肿瘤组织中的作用研究较少且不一致，因此间质解释仅为若干可能生物学解释之一，不是确定性机制结论。腺鳞癌组织学在本队列为最强临床病理预测因子，独立与DFS和OS相关；胰腺腺鳞癌为公认变异型，生物学不同于经典型PDAC，包括增殖指数较高、突变背景不同及鳞状分化模式与切除后较差结局相关，提示术后风险分层应单独考虑该亚型。局限性包括：样本量小、单中心、统计效能和外推性有限，回归估计置信区间较宽；仅50例且部分终点事件数有限，每变量事件数偏少，多变量logistic和Cox模型稳定性可能受影响，OR和HR应谨慎解释；仅21例有配对癌旁组织，肿瘤与正常组织比较的配对子集较小，可能不能完全代表 ??研究人群生物学变异；缺乏独立验证队列，生物标志物发现和评价在同一人群完成，可重复性待确立；多种miRNA和多个临床终点未进行多重比较正式校正，不能排除I型错误和假阳性，关联应视为探索性；回顾性设计存在选择和信息偏倚；中位数二分类虽常用但可在小队列放大噪声；未进行所提机制的功能验证，间质活性和EMT推断属假设生成；仅分析肿瘤组织，血浆或激光显微切割（laser-capture microdissection）间质区室平行检测有助于区分上皮和间质贡献。未来可对FFPE切片行激光显微切割分离恶性上皮/肿瘤和间质区室后再定量miRNA，以减少肿瘤纯度和间质丰度差异混杂；免疫组织化学或细胞类型标志物多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence）可进一步刻画恶性上皮细胞和成纤维间质群体空间分布；更先进的空间和单细胞方法可解析肿瘤微环境内细胞特异分子程序和交互。若在更大型前瞻性队列验证，miR-143和miR-29b组织表达可能补充肿瘤分期、淋巴结状态、切缘状态和组织学亚型等既有临床病理预后因素，改善切除PDAC术后风险分层，并可能识别早期复发高风险患者，用于强化术后监测、临床试验入组或未来生物标志物导向治疗策略；但现有发现应视为初步，这些miRNA在独立验证并在更大人群标准化前尚不适合常规临床使用。研究结论（翻译）：在接受辅助化疗的切除PDAC患者中，肿瘤残留miR-143和miR-29b较高表达分别独立与局部复发和较短无病生存相关。这些发现具有探索性，在这些生物标志物可考虑用于临床风险分层之前，需在更大型独立前瞻性队列中验证。