中国广东人源Haemaphysalis hystricis线粒体全基因组特征、种内比较及系统发育意义

《Mitochondrial DNA Part A》：Characterization of the complete mitochondrial genome of Haemaphysalis hystricis and its phylogenetic implications

　　

Haemaphysalis hystricis是一种医学上重要的蜱传媒介，先前已报道了3个来自不同地理区域和宿主标本的完整线粒体基因组。本研究对采集自中国广东省韶关市人宿主的H. hystricis标本的完整线粒体基因组进行了测序和分析，并与其先前发表的H. hystricis线粒体基因组进行了系统比较。该完整线粒体基因组长度为14,714 bp，包含13个蛋白编码基因（protein-coding genes, PCGs）、22个转运RNA（transfer RNA, tRNA）基因、2个核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）基因和两个非编码控制区（non-coding control regions, CRs）。总体基因顺序和组成高度保守，与其他血蜱属物种报道一致。该基因组呈现强烈的A + T核苷酸偏好，这是硬蜱线粒体基因组的典型特征。大多数tRNA折叠为典型三叶草二级结构，而若干tRNA呈现截短结构，反映了节肢动物线粒体tRNA结构简化的常见模式。选择压力分析表明，所有13个PCGs均处于纯化选择（purifying selection）。最大似然（maximum-likelihood, ML）系统发育分析显示，H. hystricis与H. longicornis亲缘关系最近，与先前研究一致。本研究提供了一个额外的H. hystricis线粒体基因组，并将其与先前发表的3个同种线粒体基因组进行比较。比较揭示了基因组长度、非编码区结构和tRNA二级结构方面的差异，并提供了基因特异性选择压力的估计。这些发现为蜱的比较大线粒体基因组学和种内遗传变异研究提供了有价值的数据。

研究背景：蜱为专性吸血体外寄生虫，按形态和生态特征一般分为硬蜱科、软蜱科和纳蜱科。H. hystricis Supino, 1897属于硬蜱科血蜱属，分布于温带和亚热带地区，在中国、日本和马来西亚有记录，主要侵染野猪、刺猬、穿山甲等野生动物及家犬等。蜱在吸血叮咬时影响宿主生长发育，并可携带和传播立克次体、伯氏疏螺旋体、巴尔通体等病毒、细菌和原虫，引起巴贝虫病、蜱传脑炎和斑点热等蜱传疾病。因此，蜱是仅次于蚊的人类病原体第二重要媒介，也是影响家畜和野生动物病原体的最重要媒介，对人类健康和畜牧生产构成威胁并造成经济损失，准确鉴定蜱种是防控蜱传疾病的重要基础。传统鉴定主要依赖形态性状和地理分布特征，需大量经验和参考数据，但同属物种形态相似、标本破损或诊断特征发育不全可能妨碍准确鉴定，导致误鉴或鉴定失败。蜱线粒体基因组具有体积小、突变率高、无重组和母系遗传等特点，常用于分子系统学、谱系地理学和分子演化研究。本研究旨在测序并表征H. hystricis完整线粒体基因组，系统分析其基因组结构特征，并将所有已发表H. hystricis线粒体基因组纳入比较分析，评估基因组组织、非编码区和tRNA二级结构的种内变异，并通过比较血蜱属内线粒体PCGs评估基因特异性选择压力，以扩展该物种线粒体基因组资源，为蜱的比较基因组学、群体遗传学、分类学和系统发育研究提供分子数据。

研究人员开展了H. hystricis线粒体基因组测序、组装、注释、比较线粒体基因组学和系统发育分析，得出其完整线粒体基因组为14,714 bp、具37个基因和两个CRs，基因顺序与组成高度保守，所有PCGs受纯化选择，H. hystricis与H. longicornis构成近缘关系的结论；该研究扩展了H. hystricis有限的线粒体基因组资源，并为种内遗传变异和血蜱属系统发育提供数据。

关键技术方法概括（不超过250字）：标本采自中国广东省韶关市罗坑镇人皮肤表面（24°31′N，113°20′E），保存于大理大学寄生虫学博物馆，编号DLU250416，依据立体显微镜下形态特征鉴定。研究人员采用Illumina NovaSeq平台PE150测序，Fastp和AdapterRemoval质控，SPAdes与GetOrganelle进行de novo组装，BLASTn确认候选contig，BWA-MEM回贴和SAMtools计算测序深度，Pilon打磨。用MITOS2注释PCGs、tRNAs和rRNAs，ARWEN预测tRNA二级结构，CGView构建环形图。用DNASTAR计算核苷酸组成、AT-skew和GC-skew，EZmito/EZcodon计算氨基酸使用频率和相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage, RSCU）。用TRF、MISA-web和RNAfold分析CRs串联重复、微卫星和二级结构。用DnaSP计算与29个其他血蜱属线粒体基因组的成对Ka、Ks和ω（Ka/Ks）。用PhyloSuite提取PCGs，MAFFT比对，IQ-TREE在GTR+F+I+R5模型下构建ML树，1,000次超快自举，iTOL可视化。

研究结果：
3.1 线粒体基因组组装与质量评估：通过测序、质控、组装、回贴和BLASTn分析，获得14,714 bp完整线粒体序列；组装图呈单一连通分量且无死端，估计长度与最终序列一致；干净reads回贴平均深度67.97×，最小29×，最大211×，全基因组无零覆盖位点；BLASTn显示与已发表血蜱属线粒体基因组相似性最高，无非靶标生物显著匹配。
3.2 线粒体基因组结构与核苷酸组成：通过注释和组成分析，发现该线粒体基因组编码37个基因，包括13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs和两个CRs；H链编码23个基因（9个PCGs和14个tRNAs），L链编码4个PCGs、8个tRNAs和2个rRNAs。A + T含量77.2%，G + C含量22.8%，A、T、G、C分别为38.4%、38.8%、9.9%、12.9%，呈明显A + T偏倚。PCGs的AT-skew为?0.124、CRs为?0.093，rRNAs为0.037；PCGs的GC-skew为?0.121，rRNAs为0.231，CRs为0.057。PCGs长度156—1,653 bp，nad5最长、atp8最短；起始密码子均为ATN，其中6个ATG、6个ATT、1个ATC；11个基因使用完整终止密码子TAN（10个TAA、1个TAG），nad4和nad6使用不完全终止密码子T。RSCU分析鉴定27个偏好密码子，TTA（Leu）RSCU最高（4.016），其后为CGA（Arg）、TCT（Ser）、TCA（Ser）、GGA（Gly）和GCT（Ala），均以A或T结尾；氨基酸使用频率最高为Leu、Ile和Phe，Cys最低。通过将新测H. hystricis的13个PCGs与29个其他血蜱属线粒体基因组成对比较，所有PCGs平均Ka/Ks均小于1，表明总体受纯化选择；cox1平均Ka/Ks最低，atp8最高，nad2、nad5和nad6较高，cox1、cox2、cox3和cob较低。
3.3 基因间隔区与重叠序列：通过基因组结构分析，发现共31个基因重叠区，累计150 bp，长度1—24 bp，最长重叠位于trnS1与trnE之间（24 bp）；鉴定16个独立基因间隔区，总长118 bp，单个长度1—24 bp，最大间隔区位于trnE至nad1和nad1至trnL2连接处，各24 bp。
3.4 tRNA、rRNA与非编码控制区：通过tRNA二级结构预测，22个tRNA长度53—68 bp，trnC最短（53 bp）、trnK最长（68 bp）；除trnC、trnF和trnS1外均可折叠为典型三叶草结构，22个tRNAs中存在U-U、U-G非规范碱基错配。rrnL（16S rRNA）位于trnL2与trnV之间，长1,203 bp；rrnS（12S rRNA）位于trnV与trnI之间，长663 bp；A + T含量分别为82.47%和79.58%。两个候选CRs中，CR1位于trnL2与trnC之间，长342 bp，A + T含量69.0%；CR2位于rrnS与trnI之间，长309 bp，A + T含量65.3%；两个CRs均未检测到串联重复序列和微卫星位点；二级结构预测显示二者均可折叠为稳定茎环（发夹样）结构，最小自由能（minimum free energy, MFE）分别为?32.0 kcal/mol和?34.7 kcal/mol。
3.5 系统发育分析：通过将新测线粒体基因组与NCBI数据库序列合并，纳入30个血蜱属序列并以Hyalomma asiaticum为外群，基于13个PCGs拼接核苷酸序列（PCG_nuc数据集，10,914 bp，含6,281个可变位点、5,258个简约信息位点）在GTR+F+I+R5模型下构建ML树，1,000次超快自举。结果显示所有采样血蜱属类群形成强支持单系支（BS = 100），并分为两大支，第二支由H. inermis、H. colasbelcouri、H. kitaokai、H. kolonini和H. yeni组成，两大支均获强支持（BS = 100）。新测H. hystricis与已发表H. hystricis线粒体基因组NC_039765聚为强支持种内支（BS = 100），该H. hystricis支与H. longicornis互为姐妹群（BS = 100），与先前报道一致。H. cornigera与H. taiwana、H. bispinosa与H. mageshimaensis、H. concinna与H. formosensis、H. nepalensis与H. tibetensis均以BS = 100形成姐妹对；第二支内H. colasbelcouri与H. kitaokai形成强支持亚支（BS = 98），H. kolonini与H. yeni形成另一强支持亚支（BS = 100）。

讨论部分总结：截至本研究，已报道3个H. hystricis完整线粒体基因组（Tian et al.、Liu et al.、Li et al.）。将新测线粒体基因组与这3个同种线粒体基因组比较，发现基因顺序和核苷酸组成高度保守，但仍检测到种内差异，包括总基因组长度、非编码区结构、rRNA基因长度、tRNA二级结构和不完全终止密码子使用差异，提示来自不同宿主和地理来源的H. hystricis种群存在线粒体遗传多样性。基于基因组测序、注释、基因内容和基因顺序分析，H. hystricis线粒体基因组为14,714 bp，具有37个基因的典型组成，与其他后生动物线粒体基因组一致；与其他血蜱属物种比较显示线粒体基因组织在属内总体保守，新测H. hystricis的基因排列和方向与已报道同种线粒体基因组相同，多数同属物种基因顺序相似，但若干物种存在谱系特异性基因重排，提示血蜱属演化中发生过偶发线粒体重排。与已发表同种线粒体基因组比较，Li et al.从猎犬采集的标本具有最长线粒体基因组，这些长度差异主要与基因间隔区、基因重叠和非编码区变异有关。H. hystricis完整线粒体基因组及13个PCGs均呈明显A + T偏倚，与已报道硬蜱一致；RSCU鉴定的27个偏好密码子均以A或T结尾，说明密码子使用模式密切反映其A + T丰富线粒体核苷酸组成。高A + T含量是后生动物线粒体基因组常见特征，被认为与其高拷贝数和快速演化动态有关；A + T含量升高降低DNA双链热稳定性，促进链解旋，并可能增加核苷酸替换频率，从而促进线粒体基因组演化。密码子使用分析显示所有PCGs起始密码子均为ATN，与其他蜱及多数节肢动物线粒体基因组一致，提示节肢动物线粒体基因组起始密码子选择在演化中高度保守。13个PCGs中nad4和nad6具有不完全终止密码子；值得注意的是，本研究表征的H. hystricis nad5具有完整终止密码子TAA，与Li et al.报道nad5具有不完全终止密码子TA构成明显种内变异；该现象在蜱中并不罕见，不完全线粒体终止密码子可通过转录后多聚腺苷酸化转化为功能性终止密码子，因此完整与不完全终止密码子之间的变异可能被容忍而不破坏翻译终止。tRNA二级结构预测显示，除trnC、trnF和trnS1外所有tRNAs均可折叠为典型三叶草结构，三者均缺乏二氢尿嘧啶臂（dihydrouridine arm, D-arm）；类似非典型线粒体tRNA结构在蜱和其他节肢动物中广泛报道，trnS1缺乏D-arm为节肢动物线粒体基因组特征，trnC缺乏D-arm在蜱螨亚纲中广泛报道，而trnF缺乏D-arm在先前发表蜱线粒体基因组中少见；尽管如此，tRNA结构简化是节肢动物中广泛存在的演化特征，常见于A + T丰富线粒体基因组，并被认为与后生动物线粒体基因组长期演化有关。现有H. hystricis线粒体基因组间在非编码区和tRNA二级结构上存在种内差异；尽管如此，所有13个PCGs平均Ka/Ks均小于1，表明这些基因受纯化选择，与其他蜱类研究一致，提示线粒体PCGs在演化中高度保守。系统发育分析将新测H. hystricis与已发表同种线粒体基因组置于强支持种内支，支持其位于血蜱属的分类位置；该H. hystricis支与H. longicornis互为姐妹群并获强自举支持，与先前线粒体系统发育研究一致，进一步支持这两个物种间密切的演化关系。

研究结论翻译：本研究表征了一个新的H. hystricis完整线粒体基因组，从而扩展了该物种有限的线粒体基因组资源。与先前发表的同种线粒体基因组比较显示，基因内容、基因排列和核苷酸组成总体保守，与血蜱属常见线粒体基因组特征一致。然而，基因组长度、某些结构特征和非编码区差异表明H. hystricis存在一定程度的种内线粒体变异。所有13个PCGs总体受纯化选择，但选择强度因基因而异，表明线粒体PCGs受到不同程度的演化约束。系统发育分析进一步支持H. hystricis的分类位置及其与H. longicornis的密切关系，与先前研究一致。鉴于目前可用的H. hystricis线粒体基因组数量有限，观察到的种内差异是否与地理分化或宿主来源相关仍有待确定。未来研究应扩大不同地理种群和宿主物种的采样，并整合线粒体和核基因组数据，以进一步阐明H. hystricis的种内遗传多样性及血蜱属内的系统发育关系。