《Molecular & Cellular Oncology》：Claudin 1 promotes blood-borne metastasis by modulating the Src/Ezrin signaling pathway in high-CLDN1 triple-negative breast cancer model
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本研究旨在阐明CLDN1在三阴性乳腺癌（TNBC）中调控迁移和转移的作用及其机制。在体内研究中，研究人员采用原位TNBC模型评估循环肿瘤细胞和肺转移情况；在体外研究中，研究人员检测了培养的TNBC细胞的迁移能力、F-肌动蛋白（F-actin）组织及蛋白表达水平
本研究旨在阐明CLDN1在三阴性乳腺癌（TNBC）中调控迁移和转移的作用及其机制。在体内研究中，研究人员采用原位TNBC模型评估循环肿瘤细胞和肺转移情况；在体外研究中，研究人员检测了培养的TNBC细胞的迁移能力、F-肌动蛋白（F-actin）组织及蛋白表达水平。研究人员通过慢病毒载体敲低或过表达CLDN1，并在CLDN1过表达细胞中使用siRNA沉默Ezrin。利用CLDN1药理学抑制剂PDS-0330可特异性降低MDA-MB-468细胞的迁移能力，但对MDA-MB-231细胞无显著影响；敲低和敲入实验进一步证实，在高CLDN1表达的TNBC细胞中，CLDN1是决定其迁移和转移能力的关键因素。对Ezrin及其与podocalyxin相互作用的研究表明，Ezrin在CLDN1促进的迁移中发挥重要作用，同时数据还显示CLDN1可促进Src信号通路的激活。综上所述，这些发现表明，在高CLDN1表达的TNBC中，CLDN1可能通过上调Src/Ezrin信号通路，在调控细胞迁移和血行转移中发挥关键作用。
研究背景与科学问题
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）因缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER-2）的表达，约占所有乳腺癌的10%-20%，表现出更高的侵袭性和转移能力，是最具侵袭性的乳腺癌亚型。由于对其生物学特性的了解不足，针对TNBC的精准治疗策略发展相对滞后。近年来，研究重点逐渐从关注“阴性”表达的经典生物标志物转向识别反映该亚型生物学特征的“阳性”生物标志物。紧密连接蛋白家族的重要成员Claudin-1（CLDN1）在多种癌症的恶性进展中发挥重要作用，但其在TNBC中的确切作用和调控机制尚不明确。已有研究表明，CLDN1在大部分TNBC病例中呈现高表达和异常定位模式，并与疾病进展正相关，提示其可能作为反映TNBC生物学特征的潜在“阳性”生物标志物和治疗靶点。因此，本研究旨在比较低CLDN1表达的MDA-MB-231和高CLDN1表达的MDA-MB-468两种TNBC细胞的迁移和转移能力，并探究CLDN1促进高表达细胞转移的分子机制。
主要技术方法概述
研究人员使用了人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7进行体外实验，并通过雌性BALB/c Nu裸鼠建立原位移植瘤模型进行体内验证。关键技术包括：利用CLDN1抑制剂PDS-0330进行药理学干预；通过慢病毒载体构建CLDN1敲低的MDA-MB-468稳定细胞株和CLDN1过表达的MCF-7稳定细胞株；利用siRNA沉默Ezrin基因；采用AP48趋化小室和Oris细胞迁移系统分别评估细胞垂直和水平迁移能力；通过鬼笔环肽染色观察F-肌动蛋白（F-actin）组织；运用蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达及磷酸化水平；通过免疫共沉淀（Co-IP）分析Ezrin与podocalyxin（PODXL）的相互作用；采用巢式PCR和实时定量PCR检测小鼠肺组织中的人细胞角蛋白19（ck19）mRNA以评估肺转移；通过免疫荧光和免疫组化分析蛋白定位和表达。
研究结果
1. 药理学抑制CLDN1损害高CLDN1 TNBC细胞的迁移
蛋白质免疫印迹证实MDA-MB-468细胞中CLDN1表达显著高于MDA-MB-231细胞。CLDN1抑制剂PDS-0330处理显著降低了MDA-MB-468细胞的垂直和水平迁移能力，并破坏了其F-actin的规则排列，导致细胞皱缩和骨架结构紊乱，但对MDA-MB-231细胞无显著影响。PDS-0330减少了磷酸化CLDN1（p-CLDN1）水平，而不改变总CLDN1表达。
2. CLDN1在体外和体内促进迁移和转移
在MDA-MB-468细胞中敲低CLDN1显著降低了总CLDN1和p-CLDN1水平，抑制了细胞迁移并破坏了F-actin结构；而在低内源性CLDN1表达的MCF-7细胞中过表达CLDN1则增强了迁移能力和F-actin的有序排列。在体内模型中，改变CLDN1表达不影响原发肿瘤的生长，但CLDN1敲低显著减少了循环肿瘤细胞（CTC）数量和肺组织中的人ck19 mRNA水平，而CLDN1过表达则产生相反效果，表明CLDN1活性调节血行播散。
3. Ezrin参与CLDN1刺激的细胞迁移
PDS-0330显著抑制了MDA-MB-468细胞中Ezrin的磷酸化，并破坏了Ezrin与PODXL的结合。在MDA-MB-468细胞中敲低CLDN1同样降低了p-Ezrin水平并削弱了Ezrin-PODXL相互作用，而在MCF-7细胞中过表达CLDN1则增强了Ezrin磷酸化和与PODXL的结合。在MCF-7/CLDN1细胞中沉默Ezrin基因后，CLDN1诱导的迁移能力和F-actin组织被显著减弱，且Ezrin-PODXL相互作用被破坏，但p-CLDN1水平未受影响，表明Ezrin是CLDN1下游的一个效应分子。
4. CLDN1促进Src信号通路激活
PDS-0330处理显著抑制了MDA-MB-468细胞中Src激酶及其下游靶点JNK和paxillin的磷酸化。在MDA-MB-468/CLDN1-sh细胞中观察到p-Src、p-JNK和p-paxillin水平显著下降，而在MCF-7/CLDN1细胞中这些磷酸化水平显著升高。在MCF-7/CLDN1细胞中敲低Ezrin并未影响Src、p-Src、p-JNK和p-paxillin的表达，表明CLDN1对Src通路的激活位于Ezrin上游。Src抑制剂AZD0530有效抑制了MCF-7/CLDN1细胞的迁移。
讨论与结论
本研究表明，在高CLDN1表达的TNBC模型中，CLDN1在调控细胞迁移和血行转移中发挥关键作用，这一作用可能与激活Src/Ezrin信号轴有关。具体而言，CLDN1通过促进Src激酶的磷酸化，进而激活下游的JNK和paxillin信号，并促进Ezrin的磷酸化及其与PODXL的相互作用，最终调控F-actin的重组和细胞迁移能力。靶向CLDN1为高CLDN1表达的TNBC提供了一种有前景的新型治疗策略。然而，研究也存在局限性，包括仅使用了两种TNBC细胞系，以及选用ER阳性的MCF-7细胞而非MDA-MB-231细胞作为CLDN1过表达的亲代细胞，这可能不完全代表TNBC的情况。尽管如此，来自药理学抑制、基因敲低和过表达三种互补实验体系的证据一致表明CLDN1表达与Src/Ezrin通路激活及增强的迁移能力之间存在正相关关系。
