甘氨酸补充通过直接抑制寄生虫与免疫调节降低墨西哥利什曼原虫感染BALB/c小鼠的病灶大小和寄生虫负荷

《Pathogens》：Glycine Supplementation Reduces Lesion Size and Parasite Burden in BALB/c Mice Infected with Leishmania mexicana

　　

甘氨酸（glycine）是一种非必需氨基酸（non-essential amino acid），具有多种生物学作用，包括抗菌和抗炎活性、细胞保护效应、神经递质功能以及潜在抗癌特性。甘氨酸补充在寄生虫病（如利什曼病）中的潜力仍研究不足。墨西哥利什曼原虫（Leishmania mexicana）是一种原虫寄生虫，是皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis, CL）的病原体之一，以慢性病灶和显著免疫病理为特征。本研究在墨西哥利什曼原虫感染的BALB/c小鼠模型中探讨甘氨酸补充对疾病进展和寄生虫控制的影响。BALB/c小鼠感染墨西哥利什曼原虫后，自感染当日起自由饮用补充甘氨酸的水。甘氨酸补充显示出保护作用，表现为病灶大小显著减小和寄生虫负荷降低。对甘氨酸处理小鼠脾细胞的细胞因子谱分析显示免疫调节作用，其特征是在墨西哥利什曼原虫前鞭毛体（promastigote）抗原刺激下，白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）产生增加，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）水平降低。体外研究表明，甘氨酸补充以剂量依赖方式抑制前鞭毛体和无鞭毛体（amastigote）生长。在富含甘氨酸培养基中培养的巨噬细胞（macrophage）显示，感染巨噬细胞的寄生虫回收减少。重要的是，在培养的宿主细胞中未观察到细胞毒性效应（cytotoxic effects）。组织病灶的组织学分析（histological analysis）显示，甘氨酸处理小鼠寄生虫负荷较低，炎症浸润减少。甘氨酸补充小鼠肝脏和肾脏组织的组织学分析显示，在所测试剂量下未检测到肝脏或肾脏的组织病理学改变（histopathological alterations）。这些发现提示，甘氨酸可能是一种有前景的抗利什曼原虫（anti-Leishmania）药物，用于控制疾病进展。甘氨酸调节宿主免疫反应和直接抑制寄生虫生长的双重能力，突显了早期补充甘氨酸在皮肤利什曼病中的潜在益处。

研究背景：甘氨酸是最小的蛋白原氨基酸，参与蛋白质、葡萄糖、肌酸、卟啉和嘌呤核苷酸等生物分子合成，并具有抗炎、细胞保护及神经递质等作用。膳食甘氨酸可能有助于代谢紊乱管理，并改善心血管疾病、炎症性疾病、肥胖、癌症、糖尿病和感染性疾病等临床结局。人血浆甘氨酸浓度约为0.17–0.33 mM，推荐日摄入量为1.5–3 g/day；但在衰老、疾病、心理应激或高强度体力活动等状态下，内源性和膳食甘氨酸可能不足以满足代谢需求。较高浓度甘氨酸补充在体外和体内研究中可预防多种疾病，并抑制微生物、哺乳动物细胞和肿瘤细胞生长，因此其作为抗菌剂以降低感染过程中微生物负荷和炎症的潜力受到关注。在利什曼原虫中，甘氨酸参与代谢通路，尤其是一碳代谢（one-carbon metabolism, 1C）；甘氨酸裂解复合体（glycine cleavage complex, GCC）和丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase, SHMT）通路在包括寄生虫在内的多种生物中保守，并关乎寄生虫生长。L. major中GCC P亚基破坏可降低寄生虫复制并延迟感染小鼠病灶发展，提示甘氨酸代谢参与寄生虫适应性和毒力。此外，宿主免疫反应是L. mexicana感染结局的重要决定因素：巨噬细胞活化及TNF-α等促炎介质通过一氧化氮产生等机制参与寄生虫控制；IL-10等调节性细胞因子可抑制巨噬细胞效应功能、利于寄生虫持续，同时限制过度炎症和组织损伤。当前甘氨酸在寄生虫病尤其是皮肤利什曼病中的潜力仍研究不足，因此研究人员提出甘氨酸可能通过改变细胞因子产生调节疾病相关炎症并发挥抗菌作用，从而降低L. mexicana感染小鼠皮肤利什曼病严重程度，并评估其作为抗Leishmania药物的潜力。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员在BALB/c小鼠中于感染当日开始给予不同浓度甘氨酸饮水补充，观察病灶发展、寄生虫负荷、脾细胞细胞因子反应、体外寄生虫生长与巨噬细胞感染后寄生虫回收，并进行组织病理学分析。结果提示甘氨酸补充可减小病灶大小、降低高浓度组寄生虫负荷，增加pLAg刺激下IL-10并降低TNF-α，直接抑制前鞭毛体和无鞭毛体生长，减少感染巨噬细胞寄生虫回收且不降低宿主细胞活力，并减轻病灶炎症浸润和寄生虫负荷，测试剂量下未见肝、肾组织病理学改变。该研究提示甘氨酸可能作为有前景的抗Leishmania药物，其调节宿主免疫反应和直接抑制寄生虫生长的双重能力突显早期补充在皮肤利什曼病中的潜在益处。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用BALB/c小鼠，来源为UNAM医学院实验医学研究单位动物设施；感染虫株为L. mexicana MHOM/MX/2011/Lacandona。感染当日开始自由饮用甘氨酸水，定期测量足垫病灶；感染后36天处死，取病灶组织以限制性稀释分析（limiting dilution assay, LDA）量化寄生虫负荷；分离脾单核细胞，以前鞭毛体裂解抗原（promastigote lysate antigen, pLAg）刺激后用ELISA检测TNF-α和IL-10；体外培养前鞭毛体和无鞭毛体并评估生长及7-AAD流式活力；制备骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs），感染后评估寄生虫回收和细胞活力；足垫、肝、肾组织行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色组织病理分析；采用ANOVA或Kruskal–Wallis检验进行统计。

研究结果：
3.1 Glycine Reduces Lesion Size and Parasitic Load：通过感染小鼠足垫病灶测量和LDA寄生虫负荷定量，发现病灶约在感染后12天出现；甘氨酸处理呈浓度依赖性减小病灶，感染后36天对照平均病灶为6.43 ± 0.54 mm，1 M组为5.03 ± 0.46 mm，400 mM组为5.50 ± 0.42 mm；50、100、200、400 mM和1 M组分别对应减少6.4%、6.7%、9.1%、14.5%和21.8%，25 mM未见减少；1 M组自第24天、400 mM组自第33天起病灶显著减小。400 mM和1 M甘氨酸使寄生虫负荷约降低七倍（对照4867 ± 1850 parasites/mg组织，1 M组747.7 ± 318.6 parasites/mg组织）；25–200 mM组未见病灶内寄生虫数显著降低，200 mM虽减小病灶但未显著降低寄生虫负荷。

3.2 Production of TNF-α and IL-10 by Splenocytes from Infected and Glycine-Supplemented BALB/c Mice：通过分离感染并补充甘氨酸小鼠脾细胞、以pLAg刺激并用ELISA检测细胞因子，发现仅在pLAg刺激条件下细胞因子产生有显著变化；1 M甘氨酸组TNF-α由对照521 pg/mL（IQR：410–631）降至156 pg/mL（IQR：74.5–200），IL-10由639 pg/mL（IQR：473–650）升至2055 pg/mL（IQR：1154–2185），约增加三倍；非刺激条件下各甘氨酸浓度间TNF-α或IL-10无统计学显著差异。结论为甘氨酸补充改变抗原诱导的细胞因子反应，表现为TNF-α降低和IL-10升高。

3.3 Analysis of L. mexicana Growth and Viability in Glycine-Supplemented Cultures：通过体外前鞭毛体和无鞭毛体培养、每日计数及7-AAD流式活力检测，发现最高浓度83.25 mM处理第5天时前鞭毛体生长降低约39%（对照1.33 × 10⁷ ± 9.6 × 10⁵，甘氨酸组8.1 × 10⁶ ± 7.5 × 10⁵），无鞭毛体生长降低58.2%（对照1.34 × 10⁷ ± 6.2 × 10⁵，甘氨酸组5.6 × 10⁶ ± 4.5 × 10⁵）；甘氨酸未显著影响两种虫体活力。去除甘氨酸后，曾暴露于高浓度甘氨酸的前鞭毛体生长与对照相当，而无鞭毛体生长仍较对照降低约15–20%，提示甘氨酸具有利什曼原虫静止作用（leishmaniostatic effect），且无鞭毛体在过量甘氨酸暴露后生长抑制更持续。

3.4 Parasite Recovery from Glycine-Treated Infected Macrophages：通过感染BMDMs后给予不同浓度甘氨酸并评估寄生虫回收及巨噬细胞活力，发现29.97 mM、43.29 mM和83.25 mM甘氨酸显著减少感染巨噬细胞寄生虫回收；83.25 mM组较对照降低约4倍（对照5.4 × 10⁵ ± 1.05 × 10⁵，甘氨酸组1.2 × 10⁵ ± 4.8 × 10⁴）；巨噬细胞活力未降低。结论为甘氨酸可影响胞内寄生虫存活或复制，且无宿主细胞毒性。

3.5 Effect of Glycine Supplementation on Histopathological Findings in L. mexicana-Infected Mice：通过足垫病灶、肝和肾H&E组织病理分析，发现对照小鼠病灶周边可见以中性粒细胞和单核-巨噬细胞为主的密集炎症浸润，并可见大量游离无鞭毛体及巨噬细胞寄生虫空泡；甘氨酸补充组炎症浸润强度降低，尤其400 mM组，游离无鞭毛体较少，寄生虫空泡内仅见小簇无鞭毛体或单个虫体附着于空泡膜；中央血管化白细胞碎裂区在各组均可见凋亡中性粒细胞和巨噬细胞及游离无鞭毛体，但1 M组附近寄生虫空泡内负荷较低；1 M甘氨酸补充小鼠肝、肾未见组织架构改变。结论为甘氨酸补充降低病灶炎症和寄生虫负荷，测试剂量下未见肝、肾组织病理学改变。

讨论总结：研究显示甘氨酸有效降低L. mexicana感染小鼠病灶寄生虫负荷，支持其抗菌作用，并与既往关于甘氨酸剂量依赖性抑制Helicobacter pylori、Staphylococcus aureus和Klebsiella pneumoniae生长的发现一致；S. aureus是皮肤利什曼病病灶常见继发细菌病原，发生率20.7%。甘氨酸的抗炎作用表现为高浓度组病灶厚度减小；200 mM减小病灶但未显著降低寄生虫负荷，可能反映其抗炎特性减轻局部组织炎症从而减小病灶，而不一定影响寄生虫负荷。甘氨酸补充降低pLAg刺激脾细胞TNF-α并增加IL-10，提示其改变抗原诱导的细胞因子反应；IL-10通常抑制寄生虫感染清除，但甘氨酸补充小鼠仍有效控制寄生虫负荷和疾病进展，可能与甘氨酸显著的利什曼原虫静止作用及IL-10介导的炎症减轻共同有关。非刺激脾细胞TNF-α在50–200 mM呈非显著下降趋势，而400 mM或1 M未见此趋势，提示甘氨酸免疫调节作用可能依赖脾细胞活化状态。讨论还指出，甘氨酸可抑制NF-κB活化、阻断钙内流并防止IκB降解；1–3 mM甘氨酸可激活甘氨酸受体（glycine receptor, GlyR），引起膜超极化、降低钙内流，从而减少细胞增殖和促炎介质合成；GlyR表达于巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞等多种免疫相关细胞。组织学所见与甘氨酸减少炎症和寄生虫负荷一致。体外实验中甘氨酸剂量依赖性抑制L. mexicana生长，可能与代谢干扰有关；高甘氨酸可能改变一碳代谢和5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-methylene-THF, Me-THF）可用性，SHMT在无鞭毛体中表达较高，可能使无鞭毛体更易受甘氨酸静止作用影响。感染巨噬细胞中高浓度甘氨酸显著减少寄生虫回收且不损害巨噬细胞活力，提示甘氨酸可能影响胞内寄生虫存活或复制；中性氨基酸转运体及甘氨酸转运体-1（glycine transporter-1, GlyT1）可能参与，但仍需研究。甘氨酸对多种细胞无毒性，对寄生虫则降低生长而不影响活力；去除甘氨酸后前鞭毛体恢复生长，支持该静止作用的暂时性，而无鞭毛体恢复延迟。研究局限包括：细胞因子分析仅限TNF-α和IL-10，未全面刻画Th1/Th2反应；巨噬细胞实验通过前鞭毛体回收和生长间接评估胞内寄生虫活力；甘氨酸补充始于感染当日、早于可检测病灶形成，反映早期补充对疾病进展的作用而非对已建立皮肤利什曼病的疗效；未量化个体饮水量，无法确定实际甘氨酸摄入量（mg/kg/day）；缺乏感染与未感染、补充与未补充的对照，且未评估其他器官，限制高浓度甘氨酸系统安全性评价。临床资料提示甘氨酸在高达90 g/day剂量下对人体安全，但近期发现高剂量甘氨酸（>500 mg/kg体质量）可能引起肾、肝细胞毒性和急性神经毒性；因此仍需进一步研究神经元变化及肝肾功能相关临床参数。基于上述发现，甘氨酸值得作为皮肤利什曼病患者的潜在抗Leishmania药物进行研究，尤其可与常规治疗联合；未来可探索与五价锑剂联合用药，以判断甘氨酸是否增强寄生虫清除或减少标准治疗不良反应。

研究结论翻译：甘氨酸被广泛认为具有多种治疗特性。本研究表明，甘氨酸对L. mexicana表现出有前景的活性。它减少病灶和培养中的寄生虫生长，同时发挥抗炎作用，可能有助于减小病灶。需要进一步研究以阐明高浓度甘氨酸在无细胞培养和巨噬细胞内抑制寄生虫生长的分子机制。此外，有必要开展研究评估甘氨酸作为抗Leishmania药物的潜力，包括其与皮肤利什曼病常规治疗联合使用。