突尼斯大突尼斯地区三座污水处理厂原进水中微生物群落的空间与时间结构：首个纵向多站点鸟枪法宏基因组调查

《Pathogens》：First Longitudinal Untargeted Metagenomic Survey Reveals Spatial and Temporal Structuring of the Microbial Community in Selected Tunisian Wastewater Treatment Plants

　　

基于污水的宏基因组学（wastewater-based metagenomics）为循环微生物提供了全面、群体水平且无偏的窗口，通过捕获整个相连人群中的信号而非仅捕获就诊个体，从而补充临床监测。在突尼斯，既往污水调查主要依赖靶向、单站点方法，使污水微生物组（wastewater microbiomes）的空间与季节动态在很大程度上尚未被表征。本研究呈现突尼斯首个针对原进水污水（raw influent wastewater）的纵向、多站点鸟枪法宏基因组（shotgun metagenomic）表征，对大突尼斯地区三座污水处理厂进行采样，服务人口约60,000至450,000人，覆盖冬夏两季的八次采样事件。在24份样本中，细菌（Bacteria）在已分类读段中占主导，Proteobacteria为优势门，Aliarcobacter为单一最丰富属。属水平丰富度（genus-level richness）在污水处理厂间存在显著差异，形成与估计服务人口平行的梯度，而群落均匀度（community evenness）在污水处理厂间保持相对稳定，并在两次采样活动间仅显示适度差异。群落结构按污水处理厂和采样活动（冬季 vs. 夏季）均存在显著差异，探索性属水平差异丰度（genus-level differential abundance）分析鉴定出与各因素相关的基本上不同的分类群集合，其中病毒属在采样活动相关分类群中呈适度过代表。靶向筛查在全部24份样本中检出临床相关细菌属和标准粪便污染标志物。在既往报道为抗菌药物耐药（AMR）基因载体的属中，Acidovorax在一座污水处理厂显著最丰富。对组装重叠群（assembled contigs）针对CARD和ResFinder数据库的专门筛查鉴定出129个非冗余注释事件，位于113个独立基因组位点（122个不同数据库基因标签），样本解析读段比对（sample-resolved read mapping）表明耐药组组成（resistome composition）在污水处理厂间及两次采样活动间存在差异。这些发现为突尼斯污水微生物组建立了群体水平宏基因组基线，证明纵向、多站点测序如何解析与环境监测相关的空间及采样活动间时间结构，以支持数据驱动的病原体优先级排序，并为符合同一健康（One Health）框架铺路。

研究背景方面，污水宏基因组学（metagenomics）可无偏刻画复杂环境基质中的微生物与遗传内容，污水汇集整个相连人群排出的生物材料，可补充依赖就诊与预先靶向检测的临床监测；污水处理厂（WWTPs）因接收家庭、医疗机构和工业等来源，被视为群体水平监测的战略节点，并适合纳入同一健康（One Health）框架。突尼斯既往研究多依赖培养、PCR/RT-qPCR等靶向方法，关注特定病原或耐药基因；已有宏基因组研究仅限Charguia污水处理厂6份样本，缺乏多站点与结构化季节设计，且中低收入国家在宏基因组监测文献中相对不足，因此需要开展纵向、多站点研究以解析污水微生物组的空间与季节结构，并建立数据驱动病原体优先级排序的基线。研究人员对大突尼斯地区三座市政污水处理厂（服务人口约60,000、350,000和450,000人，合计约860,000人）开展首个纵向多站点鸟枪法宏基因组调查，于2022年冬季和夏季共8次采样事件获得24份原进污水样本，分析细菌分类组成、属水平α/β多样性、差异丰度、临床相关类群与粪便污染标志物，并进行耐药组（resistome）分析；结论显示细菌占已分类读段主导，Proteobacteria为优势门、Aliarcobacter为最丰富属，群落结构受污水处理厂和采样活动显著影响，属水平丰富度在厂间呈与估计服务人口平行的梯度，耐药组组成亦呈空间与采样活动间差异，为突尼斯污水微生物组提供群体水平宏基因组基线，并提示专用耐药组分析对One Health环境监测的重要性。
关键技术方法概括（≤250字）：样本队列来源于突尼斯大突尼斯地区三座市政WWTPs，服务人口分别约60,000、350,000和450,000人；冬季5次、夏季3次采样事件，共24份50 mL原进污水抓取样，采集期为2022年1月11日至2月8日及6月29日至7月13日。提取总核酸后，采用Illumina DNA Prep with Enrichment建库，并在MiSeq和NovaSeq X平台进行2×150 bp双端测序。使用SqueezeMeta v1.6.5共组装模式，MEGAHIT组装，DIAMOND比对NCBI nr、eggNOG和KEGG数据库进行分类与功能注释，Bowtie2进行样本解析读段映射；以MetaBAT2和MaxBin2分箱、DAS_Tool去冗余、CheckM2评估宏基因组组装基因组（MAGs）质量。下游在R中使用SQMtools及vegan、ALDEx2等开展稀疏化、α/β多样性、PERMANOVA、差异丰度和日期分层分析；并用ABRicate针对CARD和ResFinder数据库筛查耐药基因。
研究结果如下。测序深度与比对质量（Sequencing depth and mapping quality）：24份样本测序深度约53.1–173.3百万读段，中位91.6百万；映射回共组装的比例为91.5%–98.9%（平均96.6%），深度变异未见与WWTP或采样期明显关联；共组装得到2,717,957个contigs、总长约1.44 Gb（N50=510 bp）。全局宏基因组读段分类（Global metagenomic read classification）：Bacteria约占42.8%–59.0%，Unclassified约25.7%–33.5%，No CDS约8.3%–21.3%，Unmapped约1.1%–8.5%，Eukaryota和Archaea一般低于0.4%，病毒读段在所有样本中检出。细菌门水平组成（Bacterial phylum-level composition）：Proteobacteria为优势门，占总读段22.8%–39.3%（均值29.6%），占细菌读段48.3%–66.6%（均值57.5%）；Bacteroidetes第二，占7.3%–13.4%（细菌内14.9%–27.9%）；Unclassified Bacteria占3.1%–6.5%；Chloroflexi在WWTP_3较高，Proteobacteria夏季较高、Fusobacteria冬季较高、Acidobacteria夏季约高一倍。优势细菌属（Dominant bacterial genera）：Aliarcobacter最丰富，占总读段5.3%–17.7%（均值10.6%）；Bacteroides第二（均值2.4%），Prevotella均值1.5%，Aeromonas均值1.2%，Acinetobacter均值0.55%；保留2,503个命名细菌属；66个去冗余MAGs中仅1个达高完整度/低污染层级、9个中等、56个低于中等，种级分辨率有限。属水平群落结构的季节分化（Seasonal divergence in genus-level community structure）：Proteobacteria内7个属夏季较高、3个属冬季较高；Bacteroidetes内6个属冬季较高、6个属夏季较高、3个差异小；两株WWTP_3冬季样本sample11_3和sample17_3呈多属共同升高的局部组成偏移，PCoA亦支持，非测序深度或映射质量异常，并提示组成性热图解释需谨慎。污水处理厂与季节间的α多样性（Alpha diversity across treatment plants and seasons）：属水平丰富度在WWTP间显著（Kruskal–Wallis p=0.0005），WWTP_1中位2,230、WWTP_2 2,467、WWTP_3 2,625，与估计服务人口平行但不能统计归因；混合模型显示WWTP_1与WWTP_2（p=0.0144）及WWTP_3（p<0.001）差异显著，WWTP_2与WWTP_3差异不显著（p=0.074），季节对丰富度无显著影响；Shannon、Simpson和Pielou在WWTP间无显著差异，混合模型仅Simpson呈 modest 季节差异（p=0.040）。β多样性与群落结构（Beta diversity and community structure）：PERMANOVA显示WWTP解释最大方差（R²=0.239，p=0.001），采样活动次之（R²=0.170，p=0.018），交互不显著；Aitchison距离结果一致；PERMDISP提示WWTP组内离散度存在异质性，季节离散度无显著差异。季节与WWTP间差异丰度（Differential abundance between seasons and treatment plants）：2,894个属中，114个（3.9%）与季节相关（探索性），93个（3.2%）与WWTP相关，二者无重叠；病毒属在季节相关类群中适度富集（16/114 vs 8.5%，OR=1.82，p=0.038），在WWTP相关类群中缺失（0/93，p<0.001）；按采样日期聚合后7个属仍显著，均为冬季富集，效应方向一致（Spearman ρ=0.92）；WWTP关联中最突出为Pseudomonas，日期分层Friedman检验识别136个显著属，Aliarcobacter为p=0.051。健康与环境相关类群（Health- and environmentally relevant taxa）：8个临床相关细菌属与CrAssphage-like标志物均在24/24样本中检出（≥10 reads），Acinetobacter和Pseudomonas最丰富；种水平8种均100%检出，Staphylococcus、Enterococcus和Acinetobacter夏季较低，Staphylococcus aureus和Acinetobacter baumannii冬季较高、Salmonella enterica夏季略高；四种既往报道的AMR基因载体属中，Acidovorax在WWTP间显著（χ²=16.9，p=0.000216，经Bonferroni校正仍显著），Acinetobacter接近阈值（p=0.0088），三属呈WWTP_1最高的趋势；KEGG筛查仅精确匹配bla-KPC和bla-OXA-48，前者24/24检出且厂间无显著差异，后者11/24检出、WWTP_3较高但未通过Bonferroni校正；CARD/ResFinder专门筛查得到129个非冗余注释事件、92个contigs、122个数据库基因标签、113个独立位点，25/66个MAGs携带至少1个ARG，Aliarcobacter所属MAGs累积ARG负担最大，但相关bin完整度低、部分污染高，应视为初步；样本解析映射显示耐药组组成在WWTP间（R²=0.230，p=0.001）和采样活动间（R²=0.250，p=0.0179）存在差异，总耐药组丰度夏季在样本水平较高（p=0.0006），按日期水平检验未显著（p=0.071），ARG丰富度无显著差异；此外，KEGG识别的bla-KPC和bla-OXA-48未被CARD/ResFinder确认。
讨论部分总结：本研究结果与多地污水宏基因组中Proteobacteria及Aliarcobacter、Acinetobacter、Aeromonas、Acidovorax等反复出现相一致，提示原污水微生物组存在跨地域保守的生态骨架；属水平丰富度呈与估计服务人口平行的厂间梯度，但仅3个站点，不能统计归因于人口规模，且Shannon、Simpson和Pielou在厂间稳定，说明丰富度变化未同步重塑优势结构。两次季节采样活动主要改变优势类群身份和耐药组组成，而总体多样性和均匀度变化有限；病毒属在季节相关类群中适度富集、在WWTP相关类群中缺失，原文强调该模式与噬菌体-宿主季节性假说一致但不能证明，且未开展病毒-宿主关联或宿主预测。文章还提示组成性热图中少数类群升高可造成多属协同变化的视觉假象。分类学上的AMR载体属与具体耐药基因检测结果可不一致：Acidovorax等在WWTP_1较高，但KEGG仅识别两个β-内酰胺酶基因且未被CARD/ResFinder确认，说明 taxonomic proxy 不能替代直接耐药组检测。KEGG对AMR分辨率有限，专用CARD/ResFinder筛查得到更丰富的耐药组目录，并显示耐药组组成的空间与采样活动结构；短读长和环境宏基因组使种级与MAG分辨率有限，种级结果应视为指示性。与突尼斯既往单站点、非季节宏基因组研究相比，本研究的纵向多站点设计可解析空间和时间结构。局限包括仅3座WWTPs、抓取样而非24 h混合样、单一年份、无现场/提取阴性对照、提取与建库批次不能与采样活动完全分离、组装片段化及80%覆盖阈值可能低估ARG、病毒未富集使病毒域读段来源不能区分、种级与病原分类需培养或临床验证。研究结论翻译：本研究提供了突尼斯首个纵向、多站点原污水微生物组的宏基因组表征，覆盖三座污水处理厂和两个对比性季节采样活动。细菌在已分类读段中占主导，Proteobacteria为优势门，Aliarcobacter为单一最丰富属。属水平丰富度在污水处理厂间显著变化，形成与估计服务人口平行的梯度，但受独立站点数限制不能仅归因于人口规模；群落结构在污水处理厂间及两次采样活动间显著不同，探索性差异丰度分析识别出114个采样活动相关（样本水平）和93个WWTP相关属，二者无重叠；病毒类群在采样活动相关属中适度富集、在WWTP相关属中缺失，该模式与噬菌体动力学和宿主季节性相容但未获证明。使用CARD和ResFinder的专门耐药组分析识别出129个注释事件（113个独立位点；122个不同数据库基因标签），其中93个位于25/66个回收MAGs中，Aliarcobacter所属基因组携带最大累积耐药基因负担，构成与该属AMR关联文献一致的初步基因组分辨观察，但因ARG阳性bin完整度低、污染升高而不能确证；KEGG早期探索性筛查识别的两个基因均未被该专门分析确认。本研究证明纵向、多站点鸟枪法宏基因组测序可用于在突尼斯群体水平刻画污水微生物组，为未来数据驱动病原体优先级排序及国内外监测比较提供基线；分类学指标与基因水平AMR指标之间的差异强调未来污水监测框架应纳入专用耐药组分析而非仅依赖分类组成；将采样设计扩展至更多污水处理厂、多年份及每个季节内重复采样，可进一步加强突尼斯及类似环境中One Health框架下环境AMR监测的证据基础。