乙二醇–NaOH混合预处理强化玉米秸秆暗发酵产氢：组分分离、糖释放与产氢性能的关联分析

《Fermentation》：Enhancing Dark Fermentative Hydrogen Production from Corn Stover Using an Ethylene Glycol–NaOH Mixture Pretreatment

　　

本研究评估了乙二醇–氢氧化钠（EG–NaOH，摩尔比8:1）混合预处理对强化玉米秸秆暗发酵生物产氢的效果。研究开展了两个独立的单因素筛选系列，分别考察预处理温度（30–110 °C，固定3 h）和预处理时间（1–9 h，固定70 °C）。在温度系列中，70 °C预处理3 h后经酶解所得还原糖浓度为29.58 g L?1，并获得所报道的最高实测产氢量109.82 mL g?1 VS（549.09 mL），约为未处理对照的9.12倍。在独立的预处理时间系列中，1–9 h处理下的产氢量范围为75.46–84.95 mL g?1 VS。因此，1 h处理被视为优先缩短工艺时间的候选条件，而非经验证的最优条件。对于温度系列中的70 °C处理，修正Gompertz模型拟合得到最大产氢量Pmax为110.16 mL g?1 VS，最大产氢速率Rmax为3.30 mL g?1 VS h?1，延迟期参数λ为4.63 h；这些参数仅作描述性解读。发酵过程中代谢物和氧化还原电位（ORP）谱发生变化；然而，所观察到的产氢结果并不支持将某一普适性ORP阈值作为产氢的必要或充分条件。终点16S rRNA基因测序显示，处理组中多个梭菌属（Clostridium）类群的相对丰度升高，而PICRUSt2预测氢化酶相关COG4624类别的相对丰度也更高（处理组0.170%对未处理组0.0482%）。这些结果均为描述性关联，并不能确立直接的生态过滤、差异氢化酶表达或酶活性增强。总体而言，EG–NaOH混合预处理提高了玉米秸秆的还原糖释放量和产氢量，但工艺优化、能量性能及所提出的因果机制仍需进一步验证。

论文解读

一、研究背景与科学问题

氢能既是化工生产的重要原料，也是交通和工业领域碳减排的清洁能源。玉米秸秆作为丰富的木质纤维素农业废弃物，含有大量纤维素和半纤维素，可为生物产氢提供可发酵碳水化合物；但其致密的木质纤维素结构使其成为研究预处理对后续生物转化影响的理想原料。在现有生物产氢技术中，暗发酵因成本低、工艺简单、反应条件温和，在利用木质纤维素生物质产氢方面具有良好的应用潜力。然而，直接对玉米秸秆进行暗发酵仍存在转化效率和产氢量低的问题，其根本原因在于复杂的木质纤维素结构中，纤维素被半纤维素和木质素包裹，限制了水解酶与多糖的接触，从而降低了可发酵糖的释放及其向氢的进一步转化。因此，预处理对提高玉米秸秆的生物可降解性和产氢潜力十分必要。

已有多种物理、化学和生物预处理方法被开发用于破坏木质纤维素的致密结构并提高其酶解消化性。有效的预处理不仅应脱除木质素，还应减少纤维素和半纤维素的损失，因为这些碳水化合物是后续产氢所需可发酵糖的主要来源。低共熔溶剂（deep eutectic solvents, DESs）因其良好的木质素溶解能力、制备简单、环境友好和潜在可回收性而在木质纤维素预处理中受到广泛关注。已有研究表明，DES预处理可有效分离木质纤维素组分，提高纤维素可及性和后续酶解效率。然而，预处理效果不能仅以木质素脱除率或产氢量来评价，因为纤维素和半纤维素的保留率也直接影响后续转化可利用的可发酵碳水化合物的数量。因此，如何在提高木质素脱除率的同时保持纤维素和半纤维素的高回收率，是一个重要问题。木质纤维素生物质的抗性与其木质素和碳水化合物之间的相互作用密切相关，包括木质素–碳水化合物复合体。基于DES预处理的表现以及木质素–碳水化合物相互作用的重要性，研究人员提出考察多组分预处理介质，包括乙二醇（EG）与NaOH的混合物。NaOH可提供碱性环境促进木质素脱除和木质纤维素解构，而EG可辅助木质素溶解并帮助减少碳水化合物的过度降解。然而，EG–NaOH预处理玉米秸秆后，木质素脱除、碳水化合物保留、结构变化、酶解及后续暗发酵产氢之间的关联尚未完全阐明。

二、研究内容与主要结论

研究人员以玉米秸秆为原料，系统考察了EG–NaOH（摩尔比8:1）混合预处理对后续酶解和暗发酵产氢的影响。研究开展了两个独立的单因素筛选系列实验：温度系列（30–110 °C，固定3 h）和时间系列（1–9 h，固定70 °C）。结果表明，在温度系列中，70 °C预处理3 h后酶解所得还原糖浓度为29.58 g L^?1，实测最高产氢量为109.82 mL g^?1 VS（549.09 mL），约为未处理对照的9.12倍。在时间系列中，1–9 h处理下的产氢量为75.46–84.95 mL g^?1 VS。修正Gompertz模型拟合显示，70 °C处理的P_max为110.16 mL g^?1 VS，R_max为3.30 mL g^?1 VS h^?1，λ为4.63 h。发酵过程中还原糖、可溶性代谢物、pH和ORP均发生时序变化，但数据不支持普适性ORP阈值作为产氢的必要或充分条件。终点16S rRNA测序显示处理组中多个梭菌属类群相对丰度升高，PICRUSt2预测氢化酶相关COG4624类别的相对丰度也更高。该研究的意义在于证实了EG–NaOH混合预处理可同时实现高效木质素脱除和碳水化合物保留，从而提高玉米秸秆的酶解糖释放和暗发酵产氢量，为木质纤维素生物质产氢的预处理策略提供了新思路。

三、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：以中国北京顺义区采集的玉米秸秆为原料，风干粉碎至20目；接种物为厌氧颗粒污泥，经35 °C恒温水浴14天去除背景甲烷值后使用。EG与NaOH按8:1摩尔比混合制备预处理介质，玉米秸秆与介质按1:20固液比在密封反应器内自生压力条件下进行预处理。预处理后固体经洗涤、真空过滤、烘干获得预处理玉米秸秆（PTCS）。酶解采用纤维素酶（Cellulase R-10，50 U mg^?1）在pH 4.8柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液中50 °C、120 r min^?1条件下进行96 h，还原糖采用DNS法测定。暗发酵在200 mL厌氧消化器中进行，接种量为10.67 g VS L^?1，接种物经90 °C热处理30 min抑制产甲烷活性，初始pH调至6.0，35 ± 1 °C恒温水浴培养72 h，24 h时重新调pH至6.0并通高纯N₂吹扫15 min。产氢量采用排水法每6 h记录，气体组成采用配备TDX-01分子筛柱和热导检测器（TCD）的气相色谱（SP-2100）测定。木质纤维素组成采用Van Soest洗涤纤维法测定。产氢动力学采用修正Gompertz模型拟合。微生物群落采用16S rRNA基因V3–V4区高通量测序（Illumina MiSeq平台），功能预测采用PICRUSt2。

四、研究结果

4.1 EG–NaOH混合预处理后回收玉米秸秆固体的组分变化

温度从30 °C升至110 °C时，回收固体中木质素占比从35.37%升至91.33%（70 °C以上超过84%）。纤维素含量在70 °C时达到峰值（83.02%），半纤维素持续降解，110 °C时仅保留27.93%。随处理时间延长（1–9 h），木质素占比从83.92%升至92.59%，半纤维素降至26.36%，9 h时固体回收率降至45%。研究指出，仅凭组分占比不能判定5 h处理在木质素脱除和纤维素保留之间达到最佳平衡，需结合糖释放和产氢量综合评价。

4.2 EG–NaOH混合预处理后的还原糖释放

未处理玉米秸秆酶解后还原糖浓度仅为6.77 ± 0.71 g/L。经EG–NaOH预处理后糖释放显著提高：30 °C时达21.84 ± 1.71 g/L，尽管木质素占比略有增加（5.50 ± 0.80%），说明木质素浓度本身不能完全解释水解改善，可及性和其他组分分布的变化可能是贡献因素。70 °C时间系列中，1–9 h处理的酶解还原糖浓度均保持在约30–31 g/L，延长处理时间带来的额外糖释放有限。因此，1 h处理被保留为后续候选条件，因为它是测试中最短的处理时间，而更长处理仅带来有限的额外还原糖释放。

4.3 不同EG–NaOH预处理条件下的产氢表现

所有组均呈现0–6 h代谢延迟期。较高预处理温度（50–110 °C）将初始产氢峰值从12 h（未处理和30 °C组）延迟至18 h，但显著提高了峰值产氢量（131.76–176.89 mL对38.48–109.91 mL）和H₂浓度（46.59–51.79%对31.41–44.48%）。累计产氢量和产氢量均呈一致趋势：未处理对照为60.20 mL（12.04 mL/g VS），30 °C时升至219.55 mL（43.91 mL/g VS），70 °C时达到峰值549.09 mL（109.82 mL/g VS，提高9.12倍）。70 °C以上无实质性提升，表明存在转化平台期。在70 °C时间系列中，所有预处理组均呈现多峰产氢曲线（18、36和60 h），主峰出现在36 h（105.04–143.87 mL），而未处理对照仅在12 h出现单峰（31.37 mL）。24–36 h产氢下降和再增加应与24 h时的pH重调和N₂吹扫干预相关。1–9 h处理产氢量稳定在377.32–424.75 mL（75.46–84.95 mL/g VS），表明1 h内已实现显著预处理效果，进一步延长处理收益递减。

4.4 基于修正Gompertz模型的动力学分析

修正Gompertz模型与累计产氢趋势吻合良好（温度系列R² = 0.972–0.991，时间系列R² = 0.972–0.977）。温度系列中，70 °C和90 °C的拟合P_max分别为110.16和112.08 mL g^?1 VS，70 °C为90 °C的98.3%；对应R_max分别为3.30和3.00 mL g^?1 VS·h^?1。时间系列中，P_max随处理时间延长逐渐增加，7 h组达到峰值87.32 mL/g VS，约为未处理的6.2倍；1 h的P_max为7 h最大估计值的89.4%。模型参数仅作描述性解读，不代表特定三阶段生物学机制的证据。

4.5 发酵特征与底物利用

4.5.1 还原糖浓度变化

EG–NaOH处理组初始还原糖浓度（10.92–14.84 g/L）高于未处理对照（3.39 g/L）。暗发酵前24 h内糖快速消耗，利用率49.8–67.3%；48 h时残余糖降至0.30–1.05 g/L（利用率85.9–92.0%）；72 h时接近耗尽（0.07–0.11 g/L），标志活跃发酵终止。未处理对照虽达到更高的24 h利用率（91.7%），但其极低的初始底物水平严格限制了总产氢量。

4.5.2 pH值变化

发酵液初始调至pH 6.0。24 h时（pH重调前），温度系列实测pH为4.48–4.64，时间系列为4.42–4.70，表明初始发酵期发生显著酸化。48 h和72 h的pH值（5.08–5.39和5.70–6.01）反映的是外部干预后的发酵状态。数据不支持普适性pH 4.5阈值推断。

4.5.3 VFAs和乙醇变化

乙酸、丁酸和乙醇是多数处理的主要检测产物，丙酸和戊酸浓度较低。温度系列中，前24 h乙酸（2.41–5.19 g/L，占TVFA的56.43–61.79%）和乙醇（589.33–792.66 mg/L）共同积累。48 h出现向丁酸型发酵的明显转变：70 °C组丁酸从2740.09升至4326.10 mg/L。72 h时70 °C和90 °C组TVFA终浓度超过10 g/L（10,478.04–12,562.73 mg/L），与其较高的累计产氢量一致。时间系列中，5 h组丁酸/乙酸比达到峰值1.63，与文献报道的产氢阈值（1.41）一致。

4.5.4 氧化还原电位变化

温度系列所有组前24 h ORP较高（?73.00至?138.00 mV），48 h时急剧降至?173.00至?224.00 mV。时间系列ORP下降较缓慢：24 h为?44.50至?87.00 mV，48 h为?109.50至?174.50 mV，72 h为?135.50至?163.50 mV。未处理对照在24 h内迅速降至?215.50 mV以下，但其底物限制导致总产氢量最低。数据不支持普适性ORP阈值作为产氢的必要或充分条件。

4.6 微生物群落分析

4.6.1 Alpha多样性分析

高通量测序获得155,152条高质量序列，聚类为788个OTU（97%相似度），Good's coverage达0.999。预处理后细菌alpha多样性降低：Sobs从713降至301（下降57.8%），ACE下降53.8%，Chao下降55.9%，Shannon指数从3.87降至2.63，Simpson指数从0.09升至0.13。这反映了预处理条件施加的强烈选择压力，富集了特定功能类群。但测序数据不能确立群落差异直接由EG–NaOH处理的生态过滤效应所致。

4.6.2 物种组成分析

门水平上，Firmicutes相对丰度从66.4%升至96.8%，而Chloroflexi（8.2%）和Proteobacteria（7.7%）等水解性菌门相对丰度大幅降低。属水平上，未处理群落以Aneurinibacillus（26.56%）、Clostridium_sensu_stricto_13（6.86%）和Anaerolineaceae（6.10%）为主；预处理后Aneurinibacillus相对丰度显著降低，产氢菌属相对丰度升高，包括Clostridium_sensu_stricto_1（31.76%）、Clostridium_sensu_stricto_11（12.21%）和Clostridium_sensu_stricto_12（5.12%），同时纤维素分解性Lachnospiraceae（26.71%）和糖分解性Weissella（11.08%）相对丰度增加。

4.6.3 功能预测

PICRUSt2预测显示，预处理与氢化酶相关基因预测相对丰度升高相关，从0.2188%升至0.4370%，其中COG4624（[FeFe]-氢化酶大亚基催化C端结构域）从0.0482%升至0.170%（约3.5倍）。铁氧还蛋白和NADH/NAD⁺相关基因预测相对丰度变化较小。这些预测与梭菌属富集一致，但并非基因拷贝数、基因表达、氢化酶合成或催化活性的直接测量。

五、讨论与结论

讨论部分指出，EG–NaOH预处理改变了回收玉米秸秆固体的组分构成，提高了酶解还原糖释放量。温度系列中70 °C处理获得最高实测产氢量109.82 mL g^?1 VS（549.09 mL），约为未处理对照的9.12倍；时间系列中1–9 h处理的产氢量为75.46–84.95 mL g^?1 VS。1 h处理被视为优先缩短工艺时间的候选条件而非验证的最优条件，7 h处理产氢量更高，但均未显示能量经济优势，也未确立全局最优条件。发酵数据显示还原糖、可溶性代谢物、pH和ORP的时序变化；由于24 h时进行了pH重调和N₂吹扫，后续发酵测量反映的是受外部干预影响的系统状态。时间系列中ORP高于?180 mV时仍发生大量产氢，而未处理对照ORP低于?200 mV但产氢量最低，因此数据不支持普适性ORP阈值。终点微生物群落谱在未处理和预处理条件间存在差异，PICRUSt2预测的功能潜力差异包括处理组COG4624预测相对丰度升高，但这些均为描述性关联，不能证明直接的生态过滤、氢化酶调控或酶活性增强。总体而言，结果支持进一步评估EG–NaOH预处理用于玉米秸秆暗发酵产氢，但直接分子测量、记录的生物学重复、残余化学物对照和过程能量分析是验证所提出机制和评估工艺优化所必需的。