黑色素瘤相关肥大细胞表型重塑：向PD-1?Chymase?表型的转化与转移及不良生存预后的关联

《OncoImmunology》：Mast cell phenotypic remodeling toward a PD-1-positive, Chymase-negative phenotype is associated with metastatic melanoma and poor survival

　　

肥大细胞（Mast cells, MCs）在组织和疾病背景下表现出表型异质性，但其在黑色素瘤中的相关性仍不明确。本研究利用与黑色素瘤球体共培养的MCs的高维表型分析、轨迹推断及转录组分析，探讨了与黑色素瘤进展相关的MC表型程序。人类黑色素瘤组织显示，尽管不同预后组之间MCs丰度相当，但MC表型组成存在差异，转移性黑色素瘤富集Tryptase?Chymase?MCs。黑色素瘤暴露诱导MC表型重塑，其特征为谱系及效应相关特征的丧失和PD-1表达增加，且在转移性黑色素瘤共培养后变化更为显著。轨迹分析与向PD-1?Chymase?表型的连续体一致，该表型在黑色素瘤组织中被检测到，并在转移性黑色素瘤的瘤内区域富集。研究人员利用实验定义的蛋白变化推导出两种与临床预后相反的MC相关转录组特征，分别反映谱系及效应富集程序与黑色素瘤重塑程序。MC-LE特征与良好生存及干扰素应答通路相关，而MC-MR特征与较差生存及肿瘤相关通路相关。这些转录组关联在多个TCGA癌症队列中延伸至黑色素瘤之外，对来自健康皮肤、基底细胞癌（basal cell carcinoma, BCC）和黑色素瘤的MCs进行的独立分析显示MC-LE相关特征存在相应差异。综上所述，这些发现支持与黑色素瘤进展相关的不同肥大细胞表型程序，并鉴定出在转移性疾病中富集且与不良生存的转录组特征相关的PD-1?Chymase?MC表型。

论文解读

一、研究背景与研究目的

肥大细胞（Mast cells, MCs）是组织驻留的固有免疫细胞，在炎症、组织修复和癌症中具有明确作用。MCs在颗粒蛋白酶含量、受体谱和对局部信号的应答方面表现出显著异质性，这种异质性使其能够根据组织微环境形成背景依赖的功能程序。MCs在多种恶性肿瘤中积聚，但其丰度与临床结局的关联存在矛盾——既有研究报道其与良好预后相关，也有研究显示其与不良预后相关。在黑色素瘤中，MC来源的介质可影响肿瘤细胞增殖、存活、血管生成及与其他免疫群体的相互作用。然而，既往研究大多基于总MC密度或单一标志物（尤其是tryptase）评估MC浸润，缺乏表型分辨能力，这可能是导致MCs在黑色素瘤中临床意义结论不一致的重要原因。

近年来，单细胞转录组研究揭示了MCs在人类健康组织中的显著异质性，识别出多种背景依赖的转录和表型程序，而非单一的终末分化状态。在人类实体瘤中，单细胞和空间分析进一步识别出具有炎症、免疫调节、抗原呈递和组织重塑特征的肿瘤相关MC程序。然而，黑色素瘤相关MCs如何随疾病进展发生表型重塑，以及这些程序与临床结局的关系，仍缺乏系统研究。

研究人员因此提出假设：与黑色素瘤微环境的相互作用与组织驻留MC表型的重塑相关，并存在与疾病进展相关的不同表型构型。为验证该假设，研究整合了人类黑色素瘤标本的组织病理学分析、高维MC表型分析、三维黑色素瘤球体-MC共培养模型、转录组分析和多重空间免疫荧光技术，旨在揭示黑色素瘤进展是否与MC表型的定性变化相关，而非单纯的总丰度差异。

二、研究内容与主要发现

研究首先分析了26例具有明确临床结局的黑色素瘤标本（13例无病生存DF，13例转移M），发现两组间MC总密度无显著差异，但转移性黑色素瘤中Tryptase?Chymase?（MC_TC）细胞比例显著收缩，而Tryptase?Chymase?（MC_T）细胞比例显著扩增，表明黑色素瘤进展与MC蛋白酶表型的定性变化相关，而非总丰度改变。通过体外三维共培养模型，研究证实黑色素瘤暴露可诱导MC表型重塑，表现为谱系和效应相关标志物（如Chymase、MRGPRX2、FcεRI、BCL2A1、CPA3等）的协同下调及PD-1、LAMP1、Cathepsin G表达上调，且转移性黑色素瘤（MMJ）诱导的重塑比原位黑色素瘤（IMJ）更为显著。轨迹分析支持MCs沿假时间轴朝向PD-1?Chymase?表型的连续体转变。基于体外蛋白变化，研究人员推导出两种MC相关转录组特征：谱系及效应富集特征（MC-LE，包含CMA1、MS4A2、MRGPRX2、BCL2A1）与黑色素瘤重塑特征（MC-MR，包含TPSB2、TPSAB1、LAMP1、CTSG）。在TCGA-SKCM队列中，MC-LE特征与良好生存相关，MC-MR特征与不良生存相关（HR=2.14，log-rank p=4.67×10??）。MC-LE特征在多个TCGA癌症队列中均显示保护性关联（合并HR=0.77）。空间组织分析进一步证实，PD-1?Chymase?MCs在转移性黑色素瘤中富集并优先定位于瘤内区域，而PD-1?Chymase?MCs在无病生存黑色素瘤中占优势。

三、主要关键技术方法

本研究采用多项关键技术：①对26例FFPE黑色素瘤标本（来自墨西哥社会保障研究所肿瘤医院，2018-2019年确诊，含13例DF和13例M）进行甲苯胺蓝染色和多重免疫荧光染色，结合QuPath软件和StarDist深度学习算法进行组织细胞计数（histocytometry）和空间分析；②利用LAD2人肥大细胞系与两种黑色素瘤球体（IMJ原位和MMJ转移）进行10天三维共培养，随后采用24参数光谱流式细胞术进行免疫表型分析；③采用UMAP降维和k-means无监督聚类、PHATE降维和Slingshot轨迹推断分析表型转变；④基于TCGA数据库（SKCM、BRCA、LUAD、LUSC、COAD、READ、PRAD队列）进行转录组特征评分、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归、limma差异表达分析和fgsea基因集富集分析；⑤利用GSE196292公开数据集（含健康皮肤、基底细胞癌和黑色素瘤来源的纯化MCs RNA-seq数据）进行独立验证。

四、研究结果

3.1 Tryptase?Chymase?MCs在转移性黑色素瘤中减少

对26例黑色素瘤标本的全切片扫描显示，DF和M组间MC密度无显著差异，MCs均优先定位于侵袭边缘和瘤周间质。但免疫荧光分析识别出三种蛋白酶表型（MC_TC双阳性、MC_T单阳性Tryptase、MC_C单阳性Chymase），发现M肿瘤中MC_TC百分比显著收缩，同时MC_T显著扩增，表明疾病进展与Chymase表达MCs的选择性减少相关。

3.2 黑色素瘤共培养促进MCs向PD-1?Tryptase?Chymase?表型重塑

通过LAD2 MCs与IMJ和MMJ黑色素瘤球体共培养10天后进行光谱流式分析，UMAP聚类识别出5个MC表型簇。对照MCs（簇1和2）高表达效应和谱系相关标志物（IL-6、FGF、MMP9、TNFα、VEGFA、MRGPRX2、FcεRI、MITF、BCL2A1、Tryptase、Chymase、CPA3），而共培养相关簇（簇3-5）显著下调这些蛋白，同时上调PD-1、LAMP1和Cathepsin G。MMJ共培养诱导的重塑比IMJ更显著，并增加PGD2S表达。

3.3 轨迹分析支持跨黑色素瘤共培养模型的MC表型重塑

Slingshot轨迹推断以簇2为根，分出三条轨迹分别终止于簇1、4和5。对照MCs主要占据终止于簇1的轨迹，IMJ共培养MCs沿终止于簇5的轨迹分布，MMJ共培养MCs沿终止于簇4的轨迹分布。MMJ条件MCs沿假时间占据更远端位置，表明其表型重塑更为广泛。沿假时间的表达动态显示谱系和效应标志物的分级丧失及PD-1上调。直接定量验证了PD-1?Chymase?MCs在共培养后显著减少，PD-1?Chymase?MCs显著富集（尤其MMJ），MRGPRX2?FcεRI?双阳性群体显著减少。

3.4 MC相关转录组特征与黑色素瘤相反生存结局相关

基于体外蛋白变化定义MC-LE（CMA1、MS4A2、MRGPRX2、BCL2A1）和MC-MR（TPSB2、TPSAB1、LAMP1、CTSG）特征（PD-1因在多种细胞广泛表达而被排除）。在TCGA-SKCM中，MC-LE高表达与较低死亡风险相关，MC-MR高表达与较高死亡风险相关。LE^Enriched与MR^Enriched患者比较显示HR=2.14。差异表达分析显示LE^Enriched富集BCL2A1、MITF、IFIH1、STAT1等干扰素相关基因，MR^Enriched富集TPSAB1、TPSB2及COL6A2、COL6A1等基质重塑基因。GSEA显示LE^Enriched富集干扰素α/γ应答、氧化磷酸化、E2F靶标、MYC靶标、mTORC1信号和同种异体排斥通路，MR^Enriched富集上皮间质转化、血管生成、缺氧、WNT/β-catenin信号和TGF-β通路。MC-LE特征在LUAD（HR=0.62）、前列腺癌（HR=0.39）和黑色素瘤（HR=0.66）中显著与降低死亡风险相关，十队列随机效应荟萃分析合并HR=0.77。GSE196292独立数据集显示MC-LE相关基因在健康皮肤和BCC来源MCs中较高，在黑色素瘤来源MCs中降低。

3.5 转移性黑色素瘤富集PD-1?Chymase?MCs

对11例标本（5例DF，6例M）进行单细胞组织细胞计数分析，证实MC^{TC PD-1?}（Tryptase?Chymase?PD-1?）在DF肿瘤中显著丰富，MC^{T PD-1?}（Tryptase?Chymase?PD-1?）在转移性黑色素瘤中显著富集。空间分析显示MC^{TC PD-1?}优先定位于肿瘤边缘，MC^{T PD-1?}主要定位于瘤内区域，且后者距肿瘤细胞更近。形态学分析显示MC^{T PD-1?}细胞面积减小、核质比增加。

五、讨论与结论

本研究揭示了黑色素瘤进展与MC表型定性变化相关而非总丰度变化。Chymase丧失是这一重塑最可重复的特征，与成熟结缔组织MC程序的改变一致。黑色素瘤暴露诱导MCs协同下调MRGPRX2和FcεRI（皮肤MCs的IgE依赖和非IgE依赖两条主要激活通路），可能意味着激活能力的改变和对微环境刺激应答能力的受限。MC-LE特征与干扰素相关免疫活性肿瘤转录背景相关，MC-MR特征与EMT、缺氧、血管生成、TGF-β和WNT/β-catenin等肿瘤侵袭和免疫逃逸相关通路相关。PD-1?Chymase?MCs在转移性黑色素瘤瘤内区域的富集，结合既往关于MCs与抗PD-1治疗抵抗的关联，提示该表型可能具有治疗相关意义，但本研究未直接评估其与CD8?T细胞功能或免疫治疗应答的因果关系。研究局限性包括：体外实验依赖LAD2永生化细胞系、空间验证样本量有限、转录组特征在bulk RNA-seq中不能明确归属单个转录本至MCs、以及研究仅建立关联而非因果关系。总体而言，本研究确定了与黑色素瘤进展相关的不同MC表型程序，并鉴定出PD-1?Chymase?MC表型在转移性疾病中富集并与不良生存的转录组特征相关，为MCs在黑色素瘤中的生物学意义提供了新的表型维度。