固态核磁共振捕获成釉蛋白组装体在引导羟基磷灰石形态发生过程中的时间分辨构象重塑

《Acta Biomaterialia》：Solid-State NMR Captures Time-Resolved Conformational Remodeling of Amelogenin Assemblies in Guiding Hydroxyapatite Morphogenesis

　　

# 摘要

amelogenin是发育中的釉质蛋白基质的主要成分，在调节釉质矿物的形态中起着关键作用。然而，amelogenin低复杂度区域中编码的内在无序性导致了结构异质性，从而在生理条件下难以实现高分辨率表征。我们假设amelogenin在调节釉质磷灰石形成过程中经历的是结构域特异性而非均匀的结构和动力学重构。本研究采用固态核磁共振（SSNMR）技术，结合扫描电子显微镜（SEM）、基于原子力显微镜的纳米级红外光谱（AFM-NanoIR）、X射线衍射（XRD）和透射电子显微镜（TEM）等互补技术，在近生理条件下，从原子到微尺度的分辨率范围内，将amelogenin的结构转变与矿物形态变化相关联。交叉极化和基于J耦合的魔角旋转（MAS）SSNMR实验描绘了在磷酸钙矿化过程中包含刚性组件和动态组件的组装景观。时间分辨追踪揭示了不同的、阶段特异性的结构域行为：N端结构域部分采用具有类淀粉性质的β-链二级构象，并在晚期生物矿化过程中逐渐获得有序性，与HAP晶体伸长同步；C端结构域保持结构刚性，但在矿化过程中发生结构重组；中心结构域随着矿化的进行变得越来越动态，这通过基于J耦合的三维NMR实验（HNCA、HNcoCA、HNCO和CBCAcoNH）得到证实，表明其较早与矿物发生相互作用，但随后蛋白-矿物接触减弱。这些结构域特异性的时空作用共同可能促成了层级矿化过程，为理解釉质形成提供了新的见解。

## 意义声明

理解自然界如何构建牙釉质等复杂材料，需要追踪蛋白质的动态作用，而这些蛋白质往往具有瞬时性。通过整合先进的固态核磁共振与高分辨率成像技术，我们首次捕捉到了无序蛋白amelogenin如何随时间重构自身以引导羟基磷灰石晶体生长的过程。我们发现，该蛋白的N端区域变得刚性并形成类淀粉支架，这与晶体伸长在时间上相关联，而中心区域则变得具有流动性。这种前所未有的时间分辨视角揭示了动态蛋白基质如何组织层级矿化，为生物启发的硬质组织合成和再生牙科治疗提供了蓝图。

## 引言

釉质是脊椎动物中最坚硬的组织，通过一个高度协调的生物矿化过程形成，该过程主要由ameloblasts在釉质发育分泌阶段分泌的主要细胞外基质蛋白amelogenin所调控[1,2]。与骨骼和牙本质中主要作为结构支架指导磷灰石晶体取向的胶原纤维不同，amelogenin尽管仅占成熟釉质基质的不到5%，却主动控制碳基羟基磷灰石（HAP）的成核、生长和组织，形成棱柱状结构，赋予釉质卓越的力学性能[4,5,6]。

Amelogenin属于内在无序蛋白（IDP）组，其特点是序列多样性低（表1）。在生理相关的高分子拥挤条件下，许多参与生物矿化的高电荷IDP经历大分子分选，形成动态蛋白-钙凝聚体，作为成核前驱体来调节生物矿化的启动和进程[7]。这种凝聚形成独立相的过程类似于蛋白质相分离的描述，该过程由多价相互作用和物理化学/微环境参数（如pH和离子强度）驱动[8]。在酸性溶液（pH 3.0）中，amelogenin以均匀单体形式存在[9]，但当溶液pH升高时，发生相转变形成聚集体或纳米球[5,10]。利用冷冻电子显微镜，Fang等人显示纳米球为由amelogenin尾对尾二聚体形成的十二聚体（pH 8.0 PBS），且纳米球能够进一步组装成凝胶[10]。虽然所得的蛋白质凝胶可通过离心高效收集[5,11]，但对该amelogenin/钙矿物体系进行的位点选择性同位素标记SSNMR研究表明，蛋白凝胶的异质结构包含具有无序结构和β-折叠构象的组分[5]。

在KLK4基因敲除小鼠（KLK4是一种在釉质成熟阶段体内可去除釉质蛋白的蛋白酶）中观察到，釉质蛋白基质包含类淀粉纳米丝带[12]。体外研究也揭示，amelogenin可以在富含钙/磷酸盐的环境中采用类淀粉结构，作为模板引导伸长磷灰石晶体的生长。因此，提出了amelogenin的功能性淀粉样支架模型[12,13,14]。Amelogenin的局部二级结构及其超分子组织代表了不同但相互关联的结构层次。无序/无规卷曲和富含β-折叠的构象描述局部蛋白结构，而纳米球、纳米丝带和纤维状聚集体代表更高层次的组织形式。有序富含β-折叠片段的形成可能促进分子间缔合，但所得的组装形态也取决于pH、离子组成、蛋白浓度和矿物相互作用。因此，将结构域特异性的构象动力学与更高层次的蛋白-矿物聚集体演变相关联，对于理解amelogenin介导的生物矿化至关重要。

此前，对结合到已有矿物上的amelogenin N端或C端片段进行的SSNMR研究需要低温条件（液氮冷却以冻结样品）才能进行基于偶极耦合的NMR实验，这强调了这些片段在与矿物结合时的动态本质[15]。相比之下，全长amelogenin与磷酸钙共沉淀产生的交叉极化（CP）信号更强且无需冷冻，表明形成了更刚性的结构组分[2,16]。Amelogenin/矿物共沉淀样品的SSNMR CP谱线宽较宽，表明蛋白结构异质性仍然存在[17,18,19]。然而，在N端结构域中识别出的β-链区域仅为全长amelogenin的一小部分，这意味着大部分蛋白是动态或无序的，未对固态NMR CP信号产生贡献。这些研究提示amelogenin与矿物的组装可能采用多种动态范围。我们假设amelogenin在调节釉质磷灰石形成过程中经历的是结构域特异性而非均匀的结构和动力学重构。我们此前的研究揭示了一个并行的过程：全长amelogenin在同时组装成类淀粉结构的同时，磷酸钙矿化为羟基磷灰石（HAP），表明蛋白自组装与矿物晶体形成之间存在直接偶联[18]。SSNMR提供了独特能力，能够在单个样品中同时研究有机和无机组分，覆盖广泛的动力学时间尺度（τc=10??-10?3 s）[20,21]，促使我们进一步研究该体系。

为了理解amelogenin如何调节磷灰石的形成，本研究采用了pH 6.0的条件。釉质成熟阶段的特征是生理酸性的细胞外环境（pH 5.5-6.0），最初由Sasaki确认为发育中釉质的正常特征而非病理状态[22]。这种酸性来源于羟基磷灰石沉积过程中的质子释放，并与具有皱褶状末端（pH 6.0-6.2）和光滑状末端（pH 7.0-7.2）的ameloblasts之间的周期性转换同步振荡，促进基质降解和晶体增厚，这对最终矿化至关重要[23,24]。在此酸性条件下，钙磷酸盐（CaP，表示任何含有PO?3?、HPO?2?或H?PO??的钙磷酸盐形式）在没有amelogenin的情况下无法转化为磷灰石[25]。先前的研究进一步表明，弱酸性钙磷酸盐矿化可能涉及brushite相关的转化以及在磷灰石形成之前存在瞬时质子化的ACP中间体[26,27]。同时，amelogenin H175和矿物在pH 6.0条件下需要数天才能形成稳定结构。因此，选择pH 6.0以提供既生理相关又具有适当时间窗口来研究amelogenin介导的磷灰石形成的条件。

此外，全长amelogenin与其第二大丰度剪接变异体——富含亮氨酸的amelogenin肽（LRAP）进行了比较，以阐明结构域特异性功能[28,29]。在自然界中，amelogenin以多种长度的多效异构体存在。LRAP仅保留了保守的N端和C端结构域，而缺乏中心疏水重复区域（表1），尽管其表达水平低于全长蛋白[30]。人类LRAP在牙齿组织中转录，然而其蛋白产物尚未从发育中的釉质基质中明确分离[31,32]。同时，小鼠LRAP与其人类对应物共享保守的结构域架构，并且在分泌阶段的釉质中易于检测。因此，小鼠LRAP也被用于本研究中作为研究釉质生物矿化中结构域特异性作用的理想模型[29,33]。

我们将扫描电子显微镜（SEM）、基于原子力显微镜的纳米级红外光谱（AFM-NanoIR）、X射线衍射（XRD）、透射电子显微镜（TEM）、选区电子衍射（SAED）、氦离子聚焦离子束显微镜（He-FIB）与SSNMR整合，以同步追踪在不同时间点从原子到微米尺度分辨率范围内的蛋白构象变化和矿物相演变。蛋白和矿物演变的时间分辨率将为理解生物矿化过程和解释蛋白结构异质性提供强有力的证据。采用基于偶极耦合的CP和基于J耦合的INEPT SSNMR实验来比较和表征矿化过程中刚性和动态蛋白结构域的共同进化。需要注意的是，当前研究中在15 kHz MAS下成功地对amelogenin H175聚集体进行了基于J耦合的三维NMR研究（HNCA、HNcoCa、HNCO和CBCAcoNH）[34]。由于这些实验依赖于多个J耦合介导的极化转移步骤，它们优先检测保留足够分子运动性的蛋白区域，为探测amelogenin聚集体的动态组分提供了有用的方法。利用这种方法，已证明amelogenin的中心结构域在由amelogenin引导的矿化末期具有高度动态性。这些发现与强调更刚性蛋白组分的基于偶极耦合的SSNMR测量形成互补。然而，在矿化成熟过程中，amelogenin不同结构域的局部结构和动力学如何随时间演变，以及这些分子尺度的变化如何伴随着超分子和矿物相的演变，仍有待解决。本研究旨在利用时间分辨固态核磁共振结合互补的结构和微观分析，表征H175 N端、中心结构和C端区域的时间依赖性构象和动力学变化，并将这些变化与amelogenin聚集体和钙磷酸盐矿物相的演变相关联。

### 片段部分

**重组amelogenin的表达与纯化**

小鼠全长amelogenin基因序列（Amelx，基因ID: 11704）包含7个外显子。共检测到九种通过选择性剪接产生的变异异构体[1]。LRAP是一种天然存在的异构体，代表包含外显子1、2、3、5、外显子6部分和外显子7的序列。人类全长amelogenin H175基因序列（AMELX，基因ID: 265），缺乏信号肽（氨基酸1-16），由通用生物系统合成。随后，克隆的基因被

**pH 6.0下全长amelogenin H175促进排列有序的磷灰石形成**

此前，我们已比较了在不同pH（4.5-6.0）条件下，在全长amelogenin H175存在时钙磷酸盐的形成及其向排列有序羟基磷灰石（HAP）的转化。酸性条件（pH 4.5-5.5）可以促进amelogenin组装成有序结构；然而，这些条件不利于钙磷酸盐矿物的沉淀。在pH 5.5时仅获得极少量的钙磷酸盐沉淀[18]。在pH 7.6条件下，HAP（Ca??(PO?)?(OH)?）形成

### 讨论

有许多有效的体外制备方法可以模拟体内釉质生物矿化过程，如pH循环法[46]和恒组成法[47]。在本研究中，我们采用了一种独特的、接近自然条件的pH 6.0环境，在该条件下矿物相以缓慢速率转化，从而避免了快速冷冻的需要，并 enables 使用多种技术进行生物矿化过程的时间分辨表征。在自然条件下，弱酸性条件

### 结论

总之，通过整合多种分析方法，特别是SSNMR，首次以蛋白残基分辨的精度研究了amelogenin生物矿化过程的时间序列事件（图1）。我们提出以下工作模型，该模型与数据一致但尚未完全证实：中心结构域以中等运动开始，可能来源于与矿物离子的相互作用，随后在两个阶段释放中等运动……

## 缩写

SSNMR，固态核磁共振；MAS，魔角旋转；SEM，扫描电子显微镜；AFM-NanoIR，基于原子力显微镜的纳米级红外光谱；XRD，X射线衍射；TEM，透射电子显微镜；He-FIB，氦离子聚焦离子束显微镜；INEPT，通过极化转移增强的无灵敏核技术；TOBSY，全键相关光谱；DARR，偶极辅助旋转共振；LRAP，富含亮氨酸的amelogenin肽；HAP，羟基磷灰石

## 关联内容

以下文件可免费获取。
- H175/矿物共聚集体的额外HIM、SEM、TEM、SAED图像和XRD衍射图谱（文件类型：PDF）
- 各种蛋白/矿物共聚集体的amelogenin聚集体的1D和2D 31P NMR、矿物的HETCOR、2D 13C-13C DARR、INEPT-TOBSY、基于J耦合的3D ssNMR光谱（文件类型：PDF）

## 作者贡献

Z.J.和J.-X.L.负责实验设计；Z.J.和J.W.负责数据收集；Z.J.、J.W.和J.-X.L.负责手稿撰写；Z.J.、B.L.和X-L.W.负责样品制备。所有作者均已批准手稿的最终版本。#这些作者贡献相同。

## 生成式AI和AI辅助技术在手稿准备过程中的声明

在准备本作品期间，作者使用了OpenAI ChatGPT来总结并生成图1。

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